Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasida CSS qo'llab-quvvatlashi cheklangan. Eng yaxshi natijalarga erishish uchun biz yangi brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublarsiz va JavaScriptsiz namoyish qilamiz.
Modik o'zgarishning (MC) hayvon modellarini yaratish MC ni o'rganish uchun muhim asos hisoblanadi. Ellik to'rtta Yangi Zelandiya oq quyonlari soxta operatsiya guruhi, mushak implantatsiyasi guruhi (ME guruhi) va nucleus pulposus implantatsiyasi guruhiga (NPE guruhi) bo'lindi. NPE guruhida intervertebral disk anterolateral bel jarrohlik yondashuvi bilan ochildi va L5 umurtqa tanasini oxirgi plastinka yaqinida teshish uchun igna ishlatildi. NP L1/2 intervertebral diskdan shprits yordamida olindi va unga kiritildi. Subkondral suyakda teshik ochildi. Mushak implantatsiyasi guruhi va soxta operatsiya guruhidagi jarrohlik muolajalar va burg'ulash usullari NP implantatsiyasi guruhidagi kabi bir xil edi. ME guruhida teshikka mushak bo'lagi joylashtirildi, soxta operatsiya guruhida esa teshikka hech narsa joylashtirilmadi. Operatsiyadan so'ng MRI skanerlash va molekulyar biologik sinovlar o'tkazildi. NPE guruhidagi signal o'zgardi, ammo soxta operatsiya guruhi va ME guruhida aniq signal o'zgarishi kuzatilmadi. Gistologik kuzatish shuni ko'rsatdiki, implantatsiya joyida g'ayritabiiy to'qima proliferatsiyasi kuzatilgan va NPE guruhida IL-4, IL-17 va IFN-γ ifodasi oshgan. NP ni subkondral suyakka implantatsiya qilish MC ning hayvon modelini shakllantirishi mumkin.
Modik o'zgarishlar (MC) - bu magnit-rezonans tomografiya (MRT) da ko'rinadigan umurtqa pog'onalari va qo'shni suyak iligining shikastlanishi. Ular bog'liq alomatlarga ega bo'lgan odamlarda juda keng tarqalgan1. Ko'pgina tadqiqotlar MC ning bel og'rig'i (LBP) bilan bog'liqligi sababli muhimligini ta'kidladi2,3. de Roos va boshqalar4 va Modik va boshqalar5 mustaqil ravishda umurtqa pog'onasi suyak iligida uch xil subkondral signal anomaliyalarini tasvirlab berishdi. Modik I turdagi o'zgarishlar T1-og'irlikdagi (T1W) ketma-ketliklarda gipointenziya va T2-og'irlikdagi (T2W) ketma-ketliklarda giperintenziyadir. Ushbu shikastlanish suyak iligida yoriq uchi plitalari va qo'shni qon tomir granulyatsiya to'qimasini ochib beradi. Modik II turdagi o'zgarishlar T1W va T2W ketma-ketliklarida yuqori signalni ko'rsatadi. Ushbu turdagi shikastlanishda uchi plastinkasining yo'q qilinishi, shuningdek, qo'shni suyak iligining gistologik yog'li almashinuvi kuzatilishi mumkin. Modik III turdagi o'zgarishlar T1W va T2W ketma-ketliklarida past signalni ko'rsatadi. Uchi plastinkalarga mos keladigan sklerotik lezyonlar kuzatilgan6. MC umurtqa pog'onasining patologik kasalligi hisoblanadi va umurtqa pog'onasining ko'plab degenerativ kasalliklari bilan chambarchas bog'liq7,8,9.
Mavjud ma'lumotlarni hisobga olgan holda, bir nechta tadqiqotlar MC ning etiologiyasi va patologik mexanizmlari haqida batafsil ma'lumot berdi. Albert va boshqalar MC disk churrasi tufayli kelib chiqishi mumkinligini ta'kidladilar8. Hu va boshqalar MC ni diskning og'ir degeneratsiyasiga bog'ladilar10. Kroc "ichki disk yorilishi" tushunchasini taklif qildi, unda takroriy disk travmasi oxirgi plastinkada mikroko'z yoshlariga olib kelishi mumkinligi aytilgan. Yoriq hosil bo'lgandan so'ng, yadro pulposus (NP) tomonidan oxirgi plastinkaning yo'q qilinishi otoimmun javobni qo'zg'atishi mumkin, bu esa MC11 ning rivojlanishiga olib keladi. Ma va boshqalar shunga o'xshash fikrda bo'lishdi va NP tomonidan qo'zg'atilgan otoimmunitet MC12 patogenezida asosiy rol o'ynashini xabar qilishdi.
Immun tizimi hujayralari, ayniqsa CD4+ T yordamchi limfotsitlar, autoimmunitet patogenezida muhim rol o'ynaydi13. Yaqinda kashf etilgan Th17 kichik to'plami yallig'lanishga qarshi sitokin IL-17 ni ishlab chiqaradi, kemokin ekspressiyasini kuchaytiradi va shikastlangan organlarda T hujayralarini IFN-γ14 ishlab chiqarish uchun rag'batlantiradi. Th2 hujayralari immun javoblarining patogenezida ham noyob rol o'ynaydi. IL-4 ning vakillik qiluvchi Th2 hujayrasi sifatida ifodalanishi jiddiy immunopatologik oqibatlarga olib kelishi mumkin15.
MC16,17,18,19,20,21,22,23,24 bo'yicha ko'plab klinik tadqiqotlar o'tkazilgan bo'lsa-da, odamlarda tez-tez uchraydigan MC jarayonini taqlid qila oladigan va etiologiyani yoki maqsadli terapiya kabi yangi davolash usullarini o'rganish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan mos hayvonlar tajriba modellari hali ham yetishmayapti. Bugungi kunga qadar MC ning faqat bir nechta hayvon modellari asosiy patologik mexanizmlarni o'rgangani haqida xabar berilgan.
Albert va Ma tomonidan taklif qilingan otoimmun nazariyaga asoslanib, ushbu tadqiqot quyonning burg'ulangan umurtqa pog'onasi plastinkasi yaqinida NPni avtotransplantatsiya qilish orqali oddiy va takrorlanadigan MC modelini yaratdi. Boshqa maqsadlar hayvon modellarining gistologik xususiyatlarini kuzatish va MC rivojlanishida NPning o'ziga xos mexanizmlarini baholashdir. Shu maqsadda biz MC rivojlanishini o'rganish uchun molekulyar biologiya, MRT va gistologik tadqiqotlar kabi usullardan foydalanamiz.
Jarrohlik paytida ikkita quyon qon ketishidan, to'rtta quyon esa MRT paytida anesteziya paytida vafot etdi. Qolgan 48 ta quyon tirik qoldi va operatsiyadan keyin hech qanday xulq-atvor yoki nevrologik belgilarni ko'rsatmadi.
MRT shuni ko'rsatadiki, turli teshiklardagi ko'milgan to'qimalarning signal intensivligi har xil. NPE guruhidagi L5 umurtqali tanasining signal intensivligi qo'shilgandan keyin 12, 16 va 20 hafta o'tgach asta-sekin o'zgarib bordi (T1W ketma-ketligi past signalni, T2W ketma-ketligi esa aralash signal va past signalni ko'rsatdi) (1C-rasm), shu bilan birga ko'milgan qismlarning boshqa ikki guruhining MRT ko'rinishlari shu davrda nisbatan barqaror bo'lib qoldi (1A, B-rasm).
(A) Quyonning bel umurtqasining 3 vaqt nuqtasida vakillik qiluvchi ketma-ket MRTlari. Soxta operatsiya guruhining tasvirlarida hech qanday signal anomaliyalari topilmadi. (B) ME guruhidagi umurtqa tanasining signal xususiyatlari soxta operatsiya guruhidagilarga o'xshash va vaqt o'tishi bilan joylashtirish joyida sezilarli signal o'zgarishi kuzatilmaydi. (C) NPE guruhida past signal T1W ketma-ketligida aniq ko'rinadi va aralash signal va past signal T2W ketma-ketligida aniq ko'rinadi. 12 haftalik davrdan 20 haftalik davrgacha T2W ketma-ketligidagi past signallarni o'rab turgan sporadik yuqori signallar kamayadi.
NPE guruhidagi umurtqali tananing implantatsiya joyida aniq suyak giperplaziyasini ko'rish mumkin va suyak giperplaziyasi NPE guruhiga nisbatan 12 haftadan 20 haftagacha tezroq sodir bo'ladi (2C-rasm), modellashtirilgan umurtqali tanalarda sezilarli o'zgarish kuzatilmaydi; Sham guruhi va ME guruhi (2C-rasm) 2A, B).
(A) Implantatsiya qilingan qismdagi umurtqa pog'onasining yuzasi juda silliq, teshik yaxshi bitadi va umurtqa pog'onasida giperplaziya yo'q. (B) ME guruhidagi implantatsiya qilingan joyning shakli soxta operatsiya guruhidagiga o'xshash va vaqt o'tishi bilan implantatsiya qilingan joyning ko'rinishida sezilarli o'zgarish yo'q. (C) NPE guruhidagi implantatsiya qilingan joyda suyak giperplaziyasi yuzaga keldi. Suyak giperplaziyasi tez o'sdi va hatto umurtqalararo disk orqali kontralateral umurtqa pog'onasiga tarqaldi.
Gistologik tahlil suyak shakllanishi haqida batafsilroq ma'lumot beradi. 3-rasmda H&E bilan bo'yalgan operatsiyadan keyingi kesmalarning fotosuratlari ko'rsatilgan. Soxta operatsiya guruhida xondrositlar yaxshi joylashtirilgan va hujayra proliferatsiyasi aniqlanmagan (3A-rasm). ME guruhidagi vaziyat soxta operatsiya guruhidagi holatga o'xshash edi (3B-rasm). Biroq, NPE guruhida implantatsiya joyida ko'p sonli xondrositlar va NPga o'xshash hujayralarning proliferatsiyasi kuzatildi (3C-rasm);
(A) Trabekulalarni oxirgi plastinka yaqinida ko'rish mumkin, xondrositlar bir xil hujayra o'lchami va shakliga ega bo'lib, tartibli joylashgan va ko'payishi yo'q (40 marta). (B) ME guruhidagi implantatsiya joyining holati soxta guruhdagi holatga o'xshaydi. Trabekulalar va xondrositlarni ko'rish mumkin, ammo implantatsiya joyida aniq ko'payish yo'q (40 marta). (B) Xondrositlar va NPga o'xshash hujayralar sezilarli darajada ko'payishi va xondrositlarning shakli va o'lchami notekis ekanligi (40 marta) ko'rinib turibdi.
Interleykin 4 (IL-4) mRNK, interleykin 17 (IL-17) mRNK va interferon γ (IFN-γ) mRNK ekspressiyasi NPE va ME guruhlarida kuzatildi. Maqsadli genlarning ekspressiya darajalari taqqoslaganda, NPE guruhida IL-4, IL-17 va IFN-γ gen ekspressiyalari ME guruhi va soxta operatsiya guruhiga nisbatan sezilarli darajada oshdi (4-rasm) (P < 0,05). Soxta operatsiya guruhi bilan taqqoslaganda, ME guruhida IL-4, IL-17 va IFN-γ ekspressiya darajalari biroz oshdi va statistik o'zgarishga erishmadi (P > 0,05).
NPE guruhidagi IL-4, IL-17 va IFN-γ ning mRNK ekspressiyasi soxta operatsiya guruhi va ME guruhidagilarga qaraganda ancha yuqori tendentsiyani ko'rsatdi (P < 0,05).
Aksincha, ME guruhidagi ifoda darajalari sezilarli farq ko'rsatmadi (P>0,05).
O'zgargan mRNK ekspressiya naqshini tasdiqlash uchun IL-4 va IL-17 ga qarshi tijoratda mavjud bo'lgan antikorlar yordamida Western blot tahlili o'tkazildi. 5A, B rasmlarda ko'rsatilganidek, ME guruhi va soxta operatsiya guruhi bilan taqqoslaganda, NPE guruhidagi IL-4 va IL-17 oqsil darajalari sezilarli darajada oshdi (P < 0,05). Soxta operatsiya guruhi bilan taqqoslaganda, ME guruhidagi IL-4 va IL-17 oqsil darajalari ham statistik jihatdan ahamiyatli o'zgarishlarga erisha olmadi (P> 0,05).
(A) NPE guruhidagi IL-4 va IL-17 oqsil darajalari ME guruhi va platsebo guruhidagiga qaraganda ancha yuqori edi (P < 0,05). (B) Western blot gistogrammasi.
Jarrohlik paytida olingan inson namunalarining cheklangan soni tufayli, MC patogenezi bo'yicha aniq va batafsil tadqiqotlar biroz qiyin. Biz MC ning potentsial patologik mexanizmlarini o'rganish uchun uning hayvon modelini yaratishga harakat qildik. Shu bilan birga, NP avtotransplantati tomonidan qo'zg'atilgan MC ning yo'nalishini kuzatish uchun radiologik baholash, gistologik baholash va molekulyar biologik baholash qo'llanildi. Natijada, NP implantatsiya modeli signal intensivligining 12 haftadan 20 haftagacha bo'lgan vaqt nuqtalariga bosqichma-bosqich o'zgarishiga olib keldi (T1W ketma-ketliklarida past signal aralash va T2W ketma-ketliklarida past signal), bu to'qima o'zgarishlarini ko'rsatadi va gistologik va molekulyar biologik baholashlar radiologik tadqiqot natijalarini tasdiqladi.
Ushbu tajriba natijalari shuni ko'rsatadiki, NPE guruhida umurtqali tananing buzilishi joyida vizual va gistologik o'zgarishlar yuz bergan. Shu bilan birga, IL-4, IL-17 va IFN-γ genlarining, shuningdek, IL-4, IL-17 va IFN-γ ning ifodalanishi kuzatildi, bu esa umurtqali tanadagi autologik yadro pulposus to'qimasining buzilishi bir qator signal va morfologik o'zgarishlarga olib kelishi mumkinligini ko'rsatadi. Hayvon modelidagi umurtqali tanalarning signal xususiyatlari (T1W ketma-ketligidagi past signal, T2W ketma-ketligidagi aralash signal va past signal) inson umurtqali hujayralarining signal xususiyatlariga juda o'xshashligini aniqlash oson va MRT xususiyatlari ham gistologiya va yalpi anatomiya kuzatuvlarini tasdiqlaydi, ya'ni umurtqali tana hujayralaridagi o'zgarishlar progressivdir. O'tkir travma natijasida kelib chiqadigan yallig'lanish reaktsiyasi ponksiyondan ko'p o'tmay paydo bo'lishi mumkin bo'lsa-da, MRT natijalari shuni ko'rsatdiki, progressiv ravishda ortib borayotgan signal o'zgarishlari ponksiyondan 12 hafta o'tgach paydo bo'ldi va MRT o'zgarishlarining tiklanish yoki tiklanish belgilarisiz 20 haftagacha davom etdi. Ushbu natijalar shuni ko'rsatadiki, autolog umurtqali NP quyonlarda progressiv MV ni aniqlashning ishonchli usuli hisoblanadi.
Ushbu ponksiyon modeli yetarli mahorat, vaqt va jarrohlik harakatlarini talab qiladi. Dastlabki tajribalarda paravertebral ligament tuzilmalarini ajratish yoki haddan tashqari stimulyatsiya qilish umurtqali osteofitlarning paydo bo'lishiga olib kelishi mumkin. Qo'shni disklarga zarar yetkazmaslik yoki ularni tirnash xususiyati keltirmaslik uchun ehtiyot bo'lish kerak. Izchil va takrorlanadigan natijalarga erishish uchun penetratsiya chuqurligini nazorat qilish kerakligi sababli, biz 3 mm uzunlikdagi ignaning qinini kesib, qo'lda tiqin yasadik. Ushbu tiqinni ishlatish umurtqa tanasida bir xil burg'ulash chuqurligini ta'minlaydi. Dastlabki tajribalarda operatsiyada ishtirok etgan uchta ortoped-jarroh 16 o'lchovli ignalar bilan 18 o'lchovli ignalar yoki boshqa usullarga qaraganda osonroq ishlashni aniqladilar. Burg'ulash paytida ortiqcha qon ketishining oldini olish uchun ignani bir muddat harakatsiz ushlab turish mosroq kiritish teshigini ta'minlaydi, bu esa ma'lum darajada MCni shu tarzda boshqarish mumkinligini ko'rsatadi.
Ko'pgina tadqiqotlar MC ga qaratilgan bo'lsa-da, MC25,26,27 ning etiologiyasi va patogenezi haqida kam narsa ma'lum. Avvalgi tadqiqotlarimizga asoslanib, biz autoimmunitet MC12 ning paydo bo'lishi va rivojlanishida muhim rol o'ynashini aniqladik. Ushbu tadqiqotda antigen stimulyatsiyasidan keyin CD4+ hujayralarining asosiy differentsiatsiya yo'llari bo'lgan IL-4, IL-17 va IFN-γ ning miqdoriy ifodalanishi o'rganildi. Bizning tadqiqotimizda, salbiy guruh bilan solishtirganda, NPE guruhida IL-4, IL-17 va IFN-γ ning yuqori ifodalanishi kuzatildi va IL-4 va IL-17 ning oqsil darajasi ham yuqori bo'ldi.
Klinik jihatdan, disk churrasi bo'lgan bemorlarning NP hujayralarida IL-17 mRNK ekspressiyasi oshgan28. Sog'lom nazorat guruhiga nisbatan o'tkir siqilmagan disk churrasi modelida IL-4 va IFN-γ ekspressiya darajasining oshishi ham aniqlangan29. IL-17 yallig'lanishda, otoimmun kasalliklarda to'qima shikastlanishida muhim rol o'ynaydi30 va IFN-γ ga immun javobni kuchaytiradi30. MRL/lpr sichqonlarida32 va otoimmunitetga sezgir sichqonlarda33 IL-17 vositachiligida to'qima shikastlanishining kuchayishi haqida xabar berilgan. IL-4 yallig'lanishga qarshi sitokinlarning (masalan, IL-1β va TNFα) ekspressiyasini va makrofaglarning faollashishini inhibe qilishi mumkin34. IL-4 ning mRNK ekspressiyasi NPE guruhida bir vaqtning o'zida IL-17 va IFN-γ ga nisbatan farq qilishi haqida xabar berilgan; NPE guruhida IFN-γ ning mRNK ekspressiyasi boshqa guruhlarga qaraganda ancha yuqori bo'lgan. Shuning uchun, IFN-γ ishlab chiqarilishi NP interkalatsiyasi natijasida kelib chiqadigan yallig'lanish javobining vositachisi bo'lishi mumkin. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, IFN-γ faollashtirilgan 1-turdagi yordamchi T hujayralari, tabiiy qotil hujayralari va makrofaglar35,36 kabi bir nechta hujayra turlari tomonidan ishlab chiqariladi va immun javoblarini rag'batlantiruvchi asosiy yallig'lanishga qarshi sitokin37 hisoblanadi.
Ushbu tadqiqot shuni ko'rsatadiki, MC ning paydo bo'lishi va rivojlanishida otoimmun javob ishtirok etishi mumkin. Luoma va boshqalar MC va ko'zga ko'ringan NP ning signal xususiyatlari MRTda o'xshashligini va ikkalasi ham T2W ketma-ketligida yuqori signalni ko'rsatishini aniqladilar38. Ba'zi sitokinlar, masalan, IL-139, MC ning paydo bo'lishi bilan chambarchas bog'liqligi tasdiqlangan. Ma va boshqalar NP ning yuqoriga yoki pastga chiqib turishi MC12 ning paydo bo'lishi va rivojlanishiga katta ta'sir ko'rsatishi mumkinligini ta'kidladilar. Bobechko40 va Herzbein va boshqalar41 NP tug'ilishdan boshlab qon aylanishiga kira olmaydigan immunotolerant to'qima ekanligini xabar qilishdi. NP chiqib ketishlari qon ta'minotiga begona jismlarni kiritadi va shu bilan mahalliy otoimmun reaktsiyalarni vositachilik qiladi42. Autoimmun reaktsiyalar ko'p sonli immun omillarini keltirib chiqarishi mumkin va bu omillar to'qimalarga doimiy ravishda ta'sir qilganda, ular signalizatsiya o'zgarishiga olib kelishi mumkin43. Ushbu tadqiqotda IL-4, IL-17 va IFN-γ ning haddan tashqari ifodalanishi odatiy immun omillar bo'lib, NP va MCs44 o'rtasidagi yaqin bog'liqlikni yana bir bor isbotlaydi. Ushbu hayvon modeli NP ning sinishi va oxirgi plastinkaga kirishini yaxshi taqlid qiladi. Bu jarayon autoimmunitetning MCga ta'sirini yanada aniqroq ko'rsatdi.
Kutilganidek, ushbu hayvon modeli bizga MC ni o'rganish uchun mumkin bo'lgan platformani taqdim etadi. Biroq, bu model hali ham ba'zi cheklovlarga ega: birinchidan, hayvonlarni kuzatish bosqichida ba'zi oraliq bosqichdagi quyonlarni gistologik va molekulyar biologiya sinovlari uchun evtanaziya qilish kerak, shuning uchun ba'zi hayvonlar vaqt o'tishi bilan "ishlatilmay qoladi". Ikkinchidan, ushbu tadqiqotda uchta vaqt nuqtasi belgilangan bo'lsa-da, afsuski, biz faqat bitta turdagi MC ni (Modik I turdagi o'zgarish) modellashtirdik, shuning uchun bu inson kasalliklarining rivojlanish jarayonini aks ettirish uchun etarli emas va barcha signal o'zgarishlarini yaxshiroq kuzatish uchun ko'proq vaqt nuqtalarini belgilash kerak. Uchinchidan, to'qima tuzilishidagi o'zgarishlarni gistologik bo'yash orqali aniq ko'rsatish mumkin, ammo ba'zi ixtisoslashgan usullar ushbu modeldagi mikrostrukturaviy o'zgarishlarni yaxshiroq ochib berishi mumkin. Masalan, quyonlarning intervertebral disklarida fibrokartilaj shakllanishini tahlil qilish uchun qutblangan yorug'lik mikroskopiyasi qo'llanildi45. NP ning MC va oxirgi plastinkaga uzoq muddatli ta'siri qo'shimcha tadqiqotlarni talab qiladi.
Ellik to'rtta erkak Yangi Zelandiya oq quyonlari (vazni taxminan 2,5-3 kg, yoshi 3-3,5 oy) tasodifiy ravishda soxta operatsiya guruhiga, mushak implantatsiyasi guruhiga (ME guruhi) va nerv ildizi implantatsiyasi guruhiga (NPE guruhi) bo'lindi. Barcha eksperimental protseduralar Tianjin kasalxonasining axloq qo'mitasi tomonidan tasdiqlandi va eksperimental usullar tasdiqlangan ko'rsatmalarga qat'iy muvofiq ravishda amalga oshirildi.
S. Sobajima 46 ning jarrohlik texnikasiga ba'zi yaxshilanishlar kiritildi. Har bir quyon lateral yotish holatiga keltirildi va ketma-ket beshta bel umurtqalararo disklarining (IVD) old yuzasi posterolateral retroperitoneal yondashuv yordamida ochildi. Har bir quyonga umumiy anesteziya berildi (20% uretan, quloq venasi orqali 5 ml/kg). Qovurg'alarning pastki chetidan tos suyagi chetigacha, ventraldan paravertebral mushaklargacha 2 sm teri kesmasi qilindi. L1 dan L6 gacha bo'lgan o'ng anterolateral umurtqa pog'onasi ustki teri osti to'qimasi, retroperitoneal to'qima va mushaklarni o'tkir va to'mtoq dissektsiya qilish orqali ochildi (6A-rasm). Disk darajasi L5-L6 disk darajasi uchun anatomik belgi sifatida tos suyagi chetidan foydalanib aniqlandi. L5 umurtqasining oxirgi plastinkasi yaqinida 3 mm chuqurlikdagi teshik ochish uchun 16 o'lchovli ignadan foydalaning (6B-rasm). L1-L2 umurtqalararo diskidagi autologik yadro pulposusni so'rib olish uchun 5 ml shpritsdan foydalaning (6C-rasm). Har bir guruh talablariga muvofiq yadro pulposusni yoki mushakni olib tashlang. Burg'ulash teshigi chuqurlashtirilgandan so'ng, chuqur fastsiya, yuzaki fastsiya va teriga so'riladigan choklar qo'yiladi, operatsiya paytida umurtqa tanasining periosteal to'qimalariga zarar yetkazmaslikka e'tibor bering.
(A) L5–L6 disk posterolateral retroperitoneal yondashuv orqali ochiladi. (B) L5 uchi plastinkasi yaqinida teshik ochish uchun 16 kalibrli ignadan foydalaning. (C) Avtolog MFlar yig'ib olinadi.
Umumiy anesteziya quloq venasiga yuborilgan 20% uretan (5 ml/kg) bilan amalga oshirildi va bel umurtqasi rentgenografiyasi operatsiyadan keyingi 12, 16 va 20 haftalarda takrorlandi.
Quyonlar operatsiyadan 12, 16 va 20 hafta o'tgach, mushak ichiga ketamin (25,0 mg/kg) va vena ichiga natriy pentobarbital (1,2 g/kg) yuborish orqali qurbon qilindi. Gistologik tahlil uchun butun umurtqa pog'onasi olib tashlandi va haqiqiy tahlil o'tkazildi. Immun omillaridagi o'zgarishlarni aniqlash uchun miqdoriy teskari transkripsiya (RT-qPCR) va Western blotting qo'llanildi.
MRT tekshiruvlari quyonlarda ortogonal oyoq-qo'l spiral qabul qilgichi bilan jihozlangan 3.0 T klinik magnit (GE Medical Systems, Florence, SC) yordamida o'tkazildi. Quyonlarga quloq venasi orqali 20% uretan (5 ml/kg) bilan anesteziya qilindi va keyin magnit ichiga chalqancha yotqizildi, bel sohasi 5 dyuymli diametrli dumaloq sirt spiraliga (GE Medical Systems) qaratildi. L3–L4 dan L5–L6 gacha bo'lgan bel diskining joylashuvini aniqlash uchun koronal T2-og'irlikdagi lokalizator tasvirlari (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) olindi. Sagittal tekislikdagi T2-og'irlikdagi bo'laklar quyidagi sozlamalar bilan olindi: takrorlanish vaqti (TR) 2200 ms va aks-sado vaqti (TE) 70 ms bo'lgan tez spin-aks-sado ketma-ketligi, matritsa; ko'rish maydoni 260 va sakkizta stimul; kesish qalinligi 2 mm, bo'shliq 0,2 mm edi.
Oxirgi fotosurat olingandan va oxirgi quyon o'ldirilgandan so'ng, gistologik tekshirish uchun soxta, mushak ichiga joylashtirilgan va NP disklari olib tashlandi. To'qimalar 1 hafta davomida 10% neytral buferlangan formalinda fiksatsiya qilindi, etilendiamintetrasirka kislotasi bilan dekaltsiylashtirildi va parafin kesildi. To'qima bloklari parafinga joylashtirildi va mikrotom yordamida sagittal kesimlarga (5 mkm qalinlikda) kesildi. Kesimlar gematoksilin va eozin (H&E) bilan bo'yaldi.
Har bir guruhdagi quyonlardan umurtqalararo disklar yig'ilgandan so'ng, ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq UNIQ-10 ustuni (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Xitoy) va ImProm II teskari transkripsiya tizimi (Promega Inc., Madison, WI, AQSh) yordamida umumiy RNK ajratib olindi. Teskari transkripsiya amalga oshirildi.
RT-qPCR ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., AQSh) va SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO, AQSh) yordamida amalga oshirildi. PCR reaksiya hajmi 20 mkl bo'lib, 1,5 mkl suyultirilgan kDNK va har bir primerdan 0,2 mkM ni tashkil etdi. Primerlar OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) tomonidan ishlab chiqilgan va Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Xitoy) tomonidan ishlab chiqarilgan (1-jadval). Quyidagi termal sikl sharoitlari qo'llanildi: 94°C da 2 daqiqa davomida dastlabki polimeraza faollashtirish bosqichi, so'ngra 94°C da shablon denaturatsiyasi uchun har biri 15 soniyadan iborat 40 sikl, 60°C da 1 daqiqa davomida tavlash, kengaytirish va floresans. O'lchovlar 72°C da 1 daqiqa davomida amalga oshirildi. Barcha namunalar uch marta kuchaytirildi va o'rtacha qiymat RT-qPCR tahlili uchun ishlatildi. Kuchaytirish ma'lumotlari FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, AQSh) yordamida tahlil qilindi. IL-4, IL-17 va IFN-γ gen ekspressiyasi endogen nazorat (ACTB) ga normallashtirildi. Maqsadli mRNKning nisbiy ekspressiya darajalari 2-ΔΔCT usuli yordamida hisoblab chiqildi.
Umumiy oqsil RIPA lizis buferidagi (proteaza va fosfataza inhibitori kokteyli o'z ichiga olgan) to'qima gomogenizatori yordamida to'qimalardan ajratib olindi va keyin to'qima qoldiqlarini olib tashlash uchun 4°C da 20 daqiqa davomida 13000 rpm tezlikda santrifuga qilindi. Har bir yo'lakka ellik mikrogramm oqsil yuklandi, 10% SDS-PAGE bilan ajratildi va keyin PVDF membranasiga o'tkazildi. Bloklash xona haroratida 1 soat davomida 0,1% Tween 20 dan iborat Tris-buferlangan sho'r suvda (TBS) 5% yog'siz quruq sutda amalga oshirildi. Membrana quyon antidekorin birlamchi antitelosi (1:200 suyultirilgan; Boster, Uxan, Xitoy) (1:200 suyultirilgan; Bioss, Pekin, Xitoy) bilan 4°C da bir kechada inkubatsiya qilindi va ikkinchi kunlarda reaksiyaga kirishdi; xona haroratida 1 soat davomida xren peroksidazasi (Boster, Uxan, Xitoy) bilan birgalikda ikkilamchi antitelo (echki quyonga qarshi immunoglobulin G 1:40,000 suyultirilgan holda) bilan. G'arbiy blot signallari rentgen nurlanishidan keyin xemilyuminestsent membranada kuchaygan xemilyuminestsentsiya orqali aniqlandi. Densitometrik tahlil uchun blotlar skanerlandi va BandScan dasturi yordamida miqdori aniqlandi va natijalar maqsadli gen immunoreaktivligining tubulin immunoreaktivligiga nisbati sifatida ifodalandi.
Statistik hisob-kitoblar SPSS16.0 dasturiy ta'minot to'plami (SPSS, AQSh) yordamida amalga oshirildi. Tadqiqot davomida to'plangan ma'lumotlar o'rtacha ± standart og'ish (o'rtacha ± SD) sifatida ifodalandi va ikki guruh o'rtasidagi farqlarni aniqlash uchun bir tomonlama takroriy o'lchovli dispersiya tahlili (ANOVA) yordamida tahlil qilindi. P < 0.05 statistik jihatdan ahamiyatli deb hisoblandi.
Shunday qilib, umurtqali tanaga avtolog NPlarni implantatsiya qilish va makroanatomik kuzatish, MRT tahlili, gistologik baholash va molekulyar biologik tahlilni amalga oshirish orqali MC ning hayvon modelini yaratish inson MC mexanizmlarini baholash va tushunish hamda yangi terapevtik aralashuvlarni ishlab chiqish uchun muhim vositaga aylanishi mumkin.
Ushbu maqolani qanday iqtibos qilish mumkin: Han, C. va boshqalar. Modik o'zgarishlarining hayvon modeli bel umurtqasining subkondral suyagiga autologik pulposus yadrosini implantatsiya qilish orqali yaratildi. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. va Boos, N. Bel umurtqasining magnit-rezonans tomografiyasi: asemptomatik ko'ngillilarda disk churrasi va ushlab turilishi, nerv ildizining siqilishi, uch plastinka anomaliyalari va faset bo'g'im osteoartritining tarqalishi. Radiologiya 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS va Leboeuf-Eed, K. Modic o'zgarishlari va ularning klinik topilmalar bilan aloqasi. Yevropa umurtqa pog'onasi jurnali: Yevropa umurtqa pog'onasi jamiyati, Yevropa umurtqa pog'onasi deformatsiyasi jamiyati va Yevropa bachadon umurtqa pog'onasi tadqiqotlari jamiyatining rasmiy nashri 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M. va boshqalar. Bel umurtqasi uchidagi modifikatsiyalangan o'zgarishlar: o'rta yoshli erkak ishchilarda bel og'rig'i va siyatikaning tarqalishi va ular bilan bog'liqligi. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. va Dalinka, M. Bel umurtqasining degenerativ kasalligida suyak iligining oxirgi plastinka yaqinidagi o'zgarishlarining MRT tekshiruvi. AJR. Amerika Radiologiya Jurnali 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ va Carter, JR Degenerativ disk kasalligi: MRT yordamida umurtqa pog'onasidagi o'zgarishlarni baholash. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS va Carter, JR Degenerativ disk kasalligini tasvirlash. Radiologiya 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS va boshqalar. Umumiy populyatsiyada neovertebral endplastinka (Modic) signal o'zgarishlarini bashorat qiluvchilar. Yevropa umurtqa pog'onasi jurnali: Yevropa umurtqa pog'onasi jamiyati, Yevropa umurtqa pog'onasi deformatsiyasi jamiyati va Yevropa servikal umurtqa pog'onasi tadqiqotlari jamiyatining rasmiy nashri, 19-bo'lim, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB va Mannisch, K. Bel disk churrasidan keyingi Modik o'zgarishlari. Yevropa umurtqa pog'onasi jurnali: Yevropa umurtqa pog'onasi jamiyati, Yevropa umurtqa pog'onasi deformatsiyasi jamiyati va Yevropa servikal umurtqa pog'onasi tadqiqotlari jamiyatining rasmiy nashri 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. va Kaapa, E. Modik I tipdagi o'zgarishlar tez rivojlanayotgan deformatsiya disk degeneratsiyasini bashorat qilishi mumkin: 1 yillik istiqbolli tadqiqot. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ va Fan, SW Modik o'zgarishlar: lomber disk degeneratsiyasining mumkin bo'lgan sabablari va hissasi. Tibbiy gipotezalar 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Ichki disk yorilishi. 50 yil davomida disk prolapsasi muammolari. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Nashr vaqti: 2024-yil 13-dekabr