nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasida CSS qo'llab-quvvatlashi cheklangan. Eng yaxshi tajriba uchun biz brauzerning eng so'nggi versiyasidan foydalanishni (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'yishni) tavsiya qilamiz. Bundan tashqari, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun ushbu sayt uslublar va JavaScriptdan xoli bo'ladi.
Skelet mushaklari asosan miofibrillardan tashkil topgan heterojen to'qima bo'lib, ular odamlarda odatda uch turga bo'linadi: bitta "sekin" (1-tur) va ikkita "tez" (2A va 2X turlari). Biroq, an'anaviy miofibril turlari orasidagi va ichidagi heterojenlik hali ham yaxshi tushunilmagan. Biz mos ravishda inson vastus lateralisdan olingan 1050 va 1038 ta individual miofibrillarga transkriptomik va proteomik yondashuvlarni qo'lladik. Proteomik tadqiqotga erkaklar, transkriptomik tadqiqotga esa 10 erkak va 2 ayol kiritilgan. Miyozin og'ir zanjir izoformlaridan tashqari, biz metabolik oqsillarni, ribosomal oqsillarni va hujayra birikma oqsillarini ko'p o'lchovli intermiofibril o'zgaruvchanligining manbalari sifatida aniqladik. Bundan tashqari, sekin va tez tolalar klasterlarini aniqlashga qaramay, bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, 2X tipdagi tolalar boshqa tez tortiladigan tolalardan fenotipik jihatdan farqlanmaydi. Bundan tashqari, miyozin og'ir zanjirga asoslangan tasnif nemalin miyopatiyalarida miofibril fenotipini tavsiflash uchun yetarli emas. Umuman olganda, bizning ma'lumotlarimiz miyofiberlarning ko'p o'lchovli heterojenligini ko'rsatadi, o'zgaruvchanlik manbalari miyosin og'ir zanjir izoformlaridan tashqariga chiqadi.
Hujayra heterojenligi barcha biologik tizimlarning ajralmas xususiyati bo'lib, hujayralarga to'qimalar va hujayralarning turli ehtiyojlarini qondirish uchun ixtisoslashish imkonini beradi.1 Skelet mushak tolasining heterojenligi haqidagi an'anaviy qarash shundan iboratki, motor neyronlari motor birligi ichidagi tola turini belgilaydi va tola turi (ya'ni, odamlarda 1-tur, 2A-tur va 2X-tur) miyozin og'ir zanjiri (MYH) izoformlarining xususiyatlari bilan belgilanadi.2 Bu dastlab ularning pH ATFaza beqarorligiga,3,4 va keyinchalik MYH ning molekulyar ifodasiga asoslangan edi.5 Biroq, turli nisbatlarda bir nechta MYH ni birgalikda ifodalaydigan "aralash" tolalarni aniqlash va keyinchalik qabul qilish bilan skelet mushak tolalari tobora ko'proq alohida tola turlari sifatida emas, balki doimiylik sifatida qaralmoqda.6 Shunga qaramay, soha hali ham MYH ga miyofiber tasnifi uchun asosiy klassifikator sifatida katta tayanadi, bu qarash, ehtimol, MYH ifoda profillari va tola turlari diapazoni odamlarnikidan farq qiladigan dastlabki kemiruvchilar tadqiqotlarining cheklovlari va sezilarli tarafkashliklari bilan bog'liq.2 Vaziyat turli xil inson skelet mushaklari turli xil tola turlarini namoyish etishi bilan yanada murakkablashadi.7 Vastus lateralis - bu oraliq (va shuning uchun vakillik qiluvchi) MYH ekspressiya profiliga ega aralash mushak.7 Bundan tashqari, namunalarni olish osonligi uni odamlarda eng yaxshi o'rganilgan mushakka aylantiradi.
Shunday qilib, kuchli "omics" vositalaridan foydalangan holda skelet mushak tolalari xilma-xilligini xolisona o'rganish juda muhim, ammo ayni paytda qiyin, qisman skelet mushak tolalarining ko'p yadroli tabiati tufayli. Biroq, so'nggi yillarda turli xil texnologik yutuqlar tufayli transkriptomika8,9 va proteomika10 texnologiyalari sezgirlikda inqilobni boshdan kechirdi, bu esa skelet mushaklarini bitta tolali aniqlikda tahlil qilish imkonini berdi. Natijada, bitta tolali xilma-xillikni va ularning atrofik stimullarga va qarishga11,12,13,14,15,16,17,18 ga javobini tavsiflashda sezilarli yutuqlarga erishildi. Muhimi, ushbu texnologik yutuqlar klinik qo'llanmalarga ega bo'lib, kasallik bilan bog'liq disregulyatsiyani batafsilroq va aniqroq tavsiflash imkonini beradi. Masalan, eng keng tarqalgan irsiy mushak kasalliklaridan biri bo'lgan nemalin miopatiyasining patofiziologiyasi (MIM 605355 va MIM 161800) murakkab va chalkash.19,20 Shuning uchun, skelet mushak tolalarining disregulyatsiyasini yaxshiroq tavsiflash ushbu kasallikni tushunishimizda sezilarli yutuqlarga olib kelishi mumkin.
Biz inson biopsiyasi namunalaridan qo'lda ajratilgan yakka skelet mushak tolalarini transkriptomik va proteomik tahlil qilish usullarini ishlab chiqdik va ularni minglab tolalarga qo'lladik, bu bizga inson skelet mushak tolalarining hujayrali heterojenligini o'rganish imkonini berdi. Ushbu ish davomida biz mushak tolalarining transkriptomik va proteomik fenotiplash kuchini namoyish etdik va metabolik, ribosomal va hujayrali birikma oqsillarini tolalararo o'zgaruvchanlikning muhim manbalari sifatida aniqladik. Bundan tashqari, ushbu proteomik ish jarayonidan foydalanib, biz yakka skelet mushak tolalarida nematod miopatiyasining klinik ahamiyatini tavsifladik va MYH asosida tola turidan mustaqil ravishda oksidlovchi bo'lmagan tolalarga muvofiqlashtirilgan siljishni aniqladik.
Inson skelet mushak tolalarining heterojenligini o'rganish uchun biz yakka skelet mushak tolalarining transkriptom va proteom tahlilini amalga oshirish uchun ikkita ish jarayonini ishlab chiqdik (1A-rasm va 1A-qo'shimcha rasm). Biz namunalarni saqlash va RNK va oqsil yaxlitligini saqlashdan tortib, har bir yondashuv uchun o'tkazuvchanlikni optimallashtirishgacha bo'lgan bir nechta metodologik bosqichlarni ishlab chiqdik va optimallashtirdik. Transkriptom tahlili uchun bunga teskari transkripsiyaning dastlabki bosqichida namunaga xos molekulyar shtrix-kodlarni kiritish orqali erishildi, bu esa samarali quyi oqimni qayta ishlash uchun 96 ta tolani birlashtirishga imkon berdi. An'anaviy yakka hujayrali yondashuvlarga nisbatan chuqurroq ketma-ketlik (har bir tola uchun ±1 million o'qish) transkriptom ma'lumotlarini yanada boyitdi. 21 Proteomika uchun biz yuqori o'tkazuvchanlikni saqlab qolish bilan birga proteom chuqurligini optimallashtirish uchun timsTOF mass-spektrometrida DIA-PASEF ma'lumotlarini olish bilan birlashtirilgan qisqa xromatografik gradientdan (21 daqiqa) foydalandik. 22,23 Sog'lom skelet mushak tolalarining heterojenligini o'rganish uchun biz 14 ta sog'lom kattalar donorlaridan olingan 1050 ta individual tolalarning transkriptomlarini va 5 ta sog'lom kattalar donorlaridan olingan 1038 ta tolaning proteomlarini tavsifladik (1-qo'shimcha jadval). Ushbu maqolada ushbu ma'lumotlar to'plamlari mos ravishda 1000 ta tolali transkriptomlar va proteomlar deb ataladi. Bizning yondashuvimiz 1000 ta tolali transkriptom va proteomik tahlillarda jami 27 237 ta transkript va 2983 ta oqsilni aniqladi (1A-rasm, Qo'shimcha ma'lumotlar to'plamlari 1-2). Transkriptom va proteomik ma'lumotlar to'plamlarini >1000 ta aniqlangan genlar va har bir tola uchun 50% haqiqiy qiymatlar uchun filtrlagandan so'ng, transkriptom va proteomdagi mos ravishda 925 va 974 ta tolalar uchun keyingi bioinformatik tahlillar o'tkazildi. Filtrlashdan so'ng, har bir tola uchun o'rtacha 4257 ± 1557 gen va 2015 ± 234 oqsil (o'rtacha ± SD) aniqlandi, individual o'zgaruvchanlik cheklangan (1B–C qo'shimcha rasmlar, 3–4 qo'shimcha ma'lumotlar to'plamlari). Biroq, sub'ekt ichidagi o'zgaruvchanlik ishtirokchilar orasida ko'proq aniqlandi, bu ehtimol turli uzunlikdagi va kesma maydonlaridagi tolalar orasidagi RNK/oqsil hosildorligidagi farqlar bilan bog'liq. Ko'pgina oqsillar uchun (>2000) o'zgarish koeffitsienti 20% dan past edi (1D qo'shimcha rasm). Ikkala usul ham mushaklarning qisqarishi uchun muhim bo'lgan yuqori ifodalangan imzolarga ega transkriptlar va oqsillarning keng dinamik diapazonini (masalan, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) olish imkonini berdi (1E–F qo'shimcha rasmlar). Aniqlangan xususiyatlarning aksariyati transkriptomik va proteomik ma'lumotlar to'plamlari o'rtasida umumiy edi (1G-qo'shimcha rasm) va bu xususiyatlarning o'rtacha UMI/LFQ intensivligi ancha yaxshi bog'liq edi (r = 0,52) (1H-qo'shimcha rasm).
Transkriptomika va proteomika ish jarayoni (BioRender.com bilan yaratilgan). BD MYH7, MYH2 va MYH1 uchun dinamik diapazon egri chiziqlari va tola turini belgilash uchun hisoblangan chegaralar. E, F Transkriptomika va proteomika ma'lumotlar to'plamlarida MYH ifodasining tolalar bo'ylab taqsimlanishi. G, H MYH asosidagi tola turi bo'yicha ranglangan transkriptomika va proteomika uchun yagona xilma-xillik yaqinlashuvi va proyeksiyasi (UMAP) grafiglari. I, J Transkriptomika va proteomika ma'lumotlar to'plamlarida MYH7, MYH2 va MYH1 ifodasini ko'rsatuvchi xususiyat grafiglari.
Dastlab biz har bir tolaga MYH asosidagi tola turini belgilashni maqsad qilgan edik, bu usul omics ma'lumotlar to'plamlarida MYH ifodasining yuqori sezgirligi va dinamik diapazonidan foydalanadi. Avvalgi tadqiqotlarda tolalarni sof 1-tur, 2A-tur, 2X-tur yoki turli MYHlarning ifodalanishining belgilangan foiziga asoslanib aralash deb belgilash uchun ixtiyoriy chegaralardan foydalanilgan11,14,24. Biz har bir tolaning ifodasi tolalarni yozish uchun foydalangan MYHlar bo'yicha tartiblangan boshqa yondashuvdan foydalandik: MYH7, MYH2 va MYH1, mos ravishda 1-tur, 2A-tur va 2X-turdagi tolalarga mos keladi. Keyin biz har bir hosil bo'lgan egri chiziqning pastki burilish nuqtasini matematik tarzda hisobladik va uni har bir MYH uchun tolalarni musbat (chegaradan yuqori) yoki manfiy (chegaradan past) deb belgilash uchun chegara sifatida ishlatdik (1B-D-rasm). Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, MYH7 (1B-rasm) va MYH2 (1C-rasm) oqsil darajasiga nisbatan RNK darajasida aniqroq yoqish/o'chirish ifoda profillariga ega. Darhaqiqat, oqsil darajasida juda oz sonli tolalar MYH7 ni ifoda etmadi va hech bir tola 100% MYH2 ifodasiga ega emas edi. Keyin biz har bir ma'lumotlar to'plamidagi barcha tolalarga MYH asosidagi tola turlarini belgilash uchun oldindan belgilangan ifoda chegaralaridan foydalandik. Masalan, MYH7+/MYH2-/MYH1- tolalar 1-turga, MYH7-/MYH2+/MYH1+ tolalari esa aralash 2A/2X turiga ajratildi (to'liq tavsif uchun 2-qo'shimcha jadvalga qarang). Barcha tolalarni birlashtirib, biz MYH asosidagi tola turlarining RNK (1E-rasm) va oqsil (1F-rasm) darajalarida juda o'xshash taqsimotini kuzatdik, MYH asosidagi tola turlarining nisbiy tarkibi esa kutilganidek, shaxslar orasida turlicha edi (2A-qo'shimcha rasm). Ko'pgina tolalar sof 1-tur (34–35%) yoki 2A-tur (36–38%) sifatida tasniflangan, garchi aralash 2A/2X turdagi tolalarning ham sezilarli miqdori aniqlangan bo'lsa ham (16–19%). Ajablanarli farq shundaki, sof 2X tipdagi tolalarni faqat RNK darajasida aniqlash mumkin, ammo oqsil darajasida emas, bu MYH ning tez ifodalanishi hech bo'lmaganda qisman transkripsiyadan keyin tartibga solinishidan dalolat beradi.
Biz proteomikaga asoslangan MYH tolasini tiplash usulimizni antikorlarga asoslangan nuqtali blotlash yordamida tasdiqladik va ikkala usul ham sof 1-toifa va 2A-toifa tolalarni aniqlashda 100% kelishuvga erishdi (2B-qo'shimcha rasmga qarang). Biroq, proteomikaga asoslangan yondashuv aralash tolalarni aniqlashda va har bir toladagi har bir MYH genining ulushini aniqlashda sezgirroq, samaraliroq edi. Ushbu ma'lumotlar skelet mushak tolasi turlarini tavsiflash uchun ob'ektiv, yuqori sezgir omikaga asoslangan yondashuvdan foydalanish samaradorligini ko'rsatadi.
Keyin biz transkriptomika va proteomika tomonidan taqdim etilgan birlashtirilgan ma'lumotlardan foydalanib, miyofiberlarni ularning to'liq transkriptomasi yoki proteomiga qarab ob'ektiv ravishda tasnifladik. O'lchamlilikni oltita asosiy komponentgacha kamaytirish uchun bir xil manifold yaqinlashuv va proektsiyalash (UMAP) usulidan foydalanib (3A-B qo'shimcha rasmlar), biz transkriptomada (1G-rasm) va proteomda (1H-rasm) miyofiber o'zgaruvchanligini tasavvur qila oldik. Shunisi e'tiborga loyiqki, miyofiberlar transkriptomika yoki proteomika ma'lumotlar to'plamlarida ishtirokchilar (3C-D qo'shimcha rasmlar) yoki sinov kunlari (3E qo'shimcha rasm) bo'yicha guruhlanmagan, bu skelet mushak tolalaridagi sub'ekt ichidagi o'zgaruvchanlik sub'ektlar orasidagi o'zgaruvchanlikdan yuqori ekanligini ko'rsatadi. UMAP diagrammasida "tez" va "sekin" miyofiberlarni ifodalovchi ikkita alohida klaster paydo bo'ldi (1G-H rasmlar). MYH7+ (sekin) miyofiberlari UMAP1 ning musbat qutbida klasterlangan, MYH2+ va MYH1+ (tezkor) miyofiberlari esa UMAP1 ning manfiy qutbida klasterlangan (1I–J-rasmlar). Biroq, MYH ifodasiga asoslangan tez tortiladigan tola turlari (ya'ni, 2A turi, 2X turi yoki aralash 2A/2X) o'rtasida hech qanday farq qilinmadi, bu MYH1 (1I–J-rasm) yoki ACTN3 yoki MYLK2 (qo'shimcha 4A–B-rasmlar) kabi boshqa klassik 2X miyofiber markerlari butun transkriptom yoki proteomni ko'rib chiqishda turli miyofiber turlari o'rtasida farq qilmasligini ko'rsatadi. Bundan tashqari, MYH2 va MYH7 bilan solishtirganda, bir nechta transkriptlar yoki oqsillar MYH1 bilan ijobiy korrelyatsiya qilingan (qo'shimcha 4C–H-rasmlar), bu MYH1 ko'pligi miyofiber transkriptom/proteomni to'liq aks ettirmasligini ko'rsatadi. Shunga o'xshash xulosalarga UMAP darajasida uchta MYH izoformasining aralash ifodasini baholashda erishildi (4I–J qo'shimcha rasmlar). Shunday qilib, 2X tolalarini faqat MYH miqdorini aniqlash asosida transkript darajasida aniqlash mumkin bo'lsa-da, MYH1+ tolalari butun transkriptom yoki proteomni ko'rib chiqishda boshqa tezkor tolalardan farq qilmaydi.
MYH dan tashqarida sekin tolali heterojenlikni dastlabki o'rganish sifatida biz to'rtta aniqlangan sekin tolali turga xos oqsillarni baholadik: TPM3, TNNT1, MYL3 va ATP2A22. Sekin tolali subtiplar transkriptomikada (5A-qo'shimcha rasm) va proteomikada (5B-qo'shimcha rasm) MYH7 bilan yuqori, ammo mukammal bo'lmagan Pearson korrelyatsiyasini ko'rsatdi. Transkriptomikada (5C-qo'shimcha rasm) va proteomikada (5D-qo'shimcha rasm) sekin tolalarning taxminan 25% va 33% mos ravishda barcha gen/oqsil subtiplari bo'yicha sof sekin tolalar sifatida tasniflanmagan. Shuning uchun, bir nechta gen/oqsil subtiplariga asoslangan sekin tolalarni tasniflash, hatto tolali turga xos bo'lgan oqsillar uchun ham qo'shimcha murakkablikni keltirib chiqaradi. Bu shuni ko'rsatadiki, bitta gen/oqsil oilasining izoformlariga asoslangan tolalarni tasniflash skelet mushak tolalarining haqiqiy heterojenligini etarli darajada aks ettirmasligi mumkin.
Inson skelet mushak tolalarining fenotipik o'zgaruvchanligini butun omiks modeli miqyosida yanada chuqurroq o'rganish uchun biz asosiy komponent tahlili (PCA) yordamida ma'lumotlarning xolis o'lchovliligini kamaytirishni amalga oshirdik (2A-rasm). UMAP grafiklariga o'xshash tarzda, na ishtirokchi, na sinov kuni PCA darajasida tola klasterizatsiyasiga ta'sir qilmadi (6A–C qo'shimcha rasmlar). Ikkala ma'lumotlar to'plamida ham MYH asosidagi tola turi PC2 tomonidan tushuntirildi, bu sekin tortiladigan 1-turdagi tolalar klasterini va tez tortiladigan 2A, 2X va aralash 2A/2X tolalarini o'z ichiga olgan ikkinchi klasterni ko'rsatdi (2A-rasm). Ikkala ma'lumotlar to'plamida ham bu ikki klaster oz sonli aralash 1/2A turdagi tolalar bilan bog'langan. Kutilganidek, asosiy PC drayverlarining ortiqcha vakillik tahlili PC2 qisqarish va metabolik imzolar tomonidan boshqarilishini tasdiqladi (2B-rasm va 6D–E qo'shimcha rasmlar, 5–6 qo'shimcha ma'lumotlar to'plamlari). Umuman olganda, MYH asosidagi tola turi PC2 bo'ylab uzluksiz o'zgarishni tushuntirish uchun yetarli ekanligi aniqlandi, tezkor klaster ichida transkriptom bo'ylab tarqalgan 2X tolalari bundan mustasno.
A. MYH asosida tola turiga qarab ranglangan transkriptom va proteom ma'lumotlar to'plamlarining asosiy komponent tahlili (PCA) grafiklari. B. PC2 va PC1 da transkript va oqsil drayverlarining boyitish tahlili. Statistik tahlil clusterProfiler paketi va Benjamin-Hochberg tomonidan sozlangan p-qiymatlari yordamida amalga oshirildi. C, D. Transkriptomdagi hujayralararo adgeziya gen ontologiyasi (GO) atamalari va proteomdagi kostamer GO atamalari bo'yicha ranglangan PCA grafiklari. Strelkalar transkript va oqsil drayverlarini va ularning yo'nalishlarini ifodalaydi. E, F. Sekin/tez tola turidan mustaqil ifoda gradientlarini ko'rsatuvchi klinik jihatdan tegishli xususiyatlarning bir xil manifold yaqinlashuvi va proektsiyasi (UMAP) xususiyat grafiklari. G, H. Transkriptomlar va proteomlarda PC2 va PC1 drayverlari o'rtasidagi korrelyatsiyalar.
Kutilmaganda, MYH asosidagi miyofiber turi faqat ikkinchi eng yuqori o'zgaruvchanlik darajasini (PC2) tushuntirdi, bu MYH asosidagi miyofiber turiga (PC1) aloqador bo'lmagan boshqa biologik omillar skelet mushak tolasi heterojenligini tartibga solishda muhim rol o'ynashini ko'rsatadi. PC1 dagi eng yaxshi drayverlarning haddan tashqari vakillik tahlili shuni ko'rsatdiki, PC1 dagi o'zgaruvchanlik asosan transkriptomdagi hujayra-hujayra adgeziyasi va ribosoma miqdori, shuningdek, proteomdagi kostameralar va ribosomal oqsillar bilan belgilanadi (2B-rasm va 6D–E qo'shimcha rasmlar, 7-qo'shimcha ma'lumotlar to'plami). Skelet mushaklarida kostameralar Z-diskni sarkolemmaga bog'laydi va kuch uzatish va signalizatsiya qilishda ishtirok etadi. 25 Hujayra-hujayra adgeziyasi (transkriptom, 2C-rasm) va kostamer (proteom, 2D-rasm) xususiyatlaridan foydalangan holda izohlangan PCA grafiklari PC1 dagi kuchli chapga siljishni aniqladi, bu esa bu xususiyatlar ma'lum tolalar bilan boyitilganligini ko'rsatadi.
UMAP darajasida miyofiber klasterlanishini batafsilroq o'rganish shuni ko'rsatdiki, aksariyat xususiyatlar miyofiber subklasteriga xos emas, balki miyofiber turiga bog'liq bo'lmagan MYH asosidagi ekspressiya gradientini namoyish etadi. Bu uzluksizlik patologik holatlar bilan bog'liq bo'lgan bir nechta genlar uchun kuzatildi (2E-rasm), masalan, CHCHD10 (neyromuskulyar kasallik), SLIT3 (mushak atrofiyasi), CTDNEP1 (mushak kasalligi). Bu uzluksizlik, shuningdek, nevrologik kasalliklar (UGDH), insulin signalizatsiyasi (PHIP) va transkripsiya (HIST1H2AB) bilan bog'liq oqsillarni o'z ichiga olgan proteom bo'ylab ham kuzatildi (2F-rasm). Umuman olganda, bu ma'lumotlar turli miyofiberlar bo'ylab tola turiga bog'liq bo'lmagan sekin/tez tortishish heterojenligidagi uzluksizlikni ko'rsatadi.
Qizig'i shundaki, PC2 dagi drayver genlari yaxshi transkriptom-proteom korrelyatsiyasini ko'rsatdi (r = 0.663) (2G-rasm), bu sekin va tez tortiladigan tola turlari, xususan, skelet mushak tolalarining qisqarish va metabolik xususiyatlari transkripsiya orqali tartibga solinishini ko'rsatadi. Biroq, PC1 dagi drayver genlari transkriptom-proteom korrelyatsiyasini ko'rsatmadi (r = -0.027) (2H-rasm), bu sekin/tez tortiladigan tola turlari bilan bog'liq bo'lmagan o'zgarishlar asosan transkripsiyadan keyin tartibga solinishini ko'rsatadi. PC1 dagi o'zgarishlar asosan ribosomal gen ontologiyasi atamalari bilan tushuntirilganligi va ribosomalar oqsil tarjimasida faol ishtirok etish va ta'sir qilish orqali hujayrada muhim va ixtisoslashgan rol o'ynashini hisobga olsak,31 biz keyin bu kutilmagan ribosomal heterojenlikni o'rganishga kirishdik.
Biz avval proteomikaning asosiy komponent tahlili grafigini GOCC "sitoplazmatik ribosoma" atamasidagi oqsillarning nisbiy ko'pligiga qarab rangladik (3A-rasm). Bu atama PC1 ning ijobiy tomonida boyitilgan bo'lsa-da, bu kichik gradientga olib keladi, ammo ribosomal oqsillar PC1 ning ikkala yo'nalishida ham bo'linishni qo'zg'atadi (3A-rasm). PC1 ning salbiy tomonida boyitilgan ribosomal oqsillar RPL18, RPS18 va RPS13 ni o'z ichiga olgan (3B-rasm), RPL31, RPL35 va RPL38 (3C-rasm) esa PC1 ning ijobiy tomonidagi asosiy qo'zg'atuvchilar bo'lgan. Qizig'i shundaki, RPL38 va RPS13 boshqa to'qimalarga nisbatan skelet mushaklarida yuqori darajada ifodalangan (7A-rasm qo'shimcha). PC1 dagi bu o'ziga xos ribosomal imzolar transkriptomada kuzatilmadi (7B-rasm qo'shimcha), bu transkripsiyadan keyingi tartibga solishni ko'rsatadi.
A. Proteom bo'ylab sitoplazmatik ribosomal gen ontologiyasi (GO) atamalariga muvofiq ranglangan asosiy komponent tahlili (PCA) grafigi. Strelkalar PCA grafigidagi oqsil vositachiligidagi o'zgarish yo'nalishini ko'rsatadi. Chiziq uzunligi berilgan oqsil uchun asosiy komponent baliga mos keladi. B, C. PCA RPS13 va RPL38 uchun grafiglarni o'z ichiga oladi. D. Sitoplazmatik ribosomal oqsillarning nazoratsiz ierarxik klasterlash tahlili. E. Skelet mushak tolalarida turli xil miqdorda ribosomal oqsillarni ajratib ko'rsatuvchi 80S ribosomasining (PDB: 4V6X) strukturaviy modeli. F. mRNK chiqish kanali yaqinida joylashgan turli stexiometriyaga ega ribosomal oqsillar.
Ribosomal heterojenlik va ixtisoslashuv tushunchalari ilgari taklif qilingan edi, bunda turli ribosoma subpopulyatsiyalarining mavjudligi (ribosoma heterojenligi) turli to'qimalarda oqsil translyatsiyasiga bevosita ta'sir qilishi mumkin32 va hujayralarda33 ma'lum mRNA transkript pullarining 34 selektiv tarjimasi (ribosoma ixtisoslashuvi). Skelet mushak tolalarida birgalikda ifodalangan ribosomal oqsillarning subpopulyatsiyalarini aniqlash uchun biz proteomdagi ribosomal oqsillarning nazoratsiz ierarxik klasterlash tahlilini o'tkazdik (3D-rasm, Qo'shimcha ma'lumotlar to'plami 8). Kutilganidek, ribosomal oqsillar MYH asosida tola turi bo'yicha klasterlashmagan. Biroq, biz ribosomal oqsillarning uchta alohida klasterini aniqladik; birinchi klaster (ribosomal_kluster_1) RPL38 bilan korregulyatsiyalangan va shuning uchun musbat PC1 profiliga ega tolalarda ifodasi oshgan. Ikkinchi klaster (ribosomal_kluster_2) RPS13 bilan korregulyatsiyalangan va manfiy PC1 profiliga ega tolalarda ko'tarilgan. Uchinchi klaster (ribosomal_cluster_3) skelet mushak tolalarida muvofiqlashtirilgan differentsial ifodani ko'rsatmaydi va uni "yadro" skelet mushak ribosomal oqsili deb hisoblash mumkin. Ikkala ribosomal klaster 1 va 2 da ilgari muqobil tarjimani tartibga solish (masalan, RPL10A, RPL38, RPS19 va RPS25) va rivojlanishga funktsional ta'sir ko'rsatishi ko'rsatilgan ribosomal oqsillar mavjud (masalan, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 PCA natijalariga muvofiq, ushbu ribosomal oqsillarning tolalar bo'ylab kuzatilgan heterojen vakili ham uzluksizlikni ko'rsatdi (7C-qo'shimcha rasm).
Ribosoma ichidagi heterojen ribosomal oqsillarning joylashuvini vizualizatsiya qilish uchun biz inson 80S ribosomasining strukturaviy modelidan foydalandik (Oqsil ma'lumotlar banki: 4V6X) (3E-rasm). Turli ribosomal klasterlarga tegishli ribosomal oqsillarni ajratib olgandan so'ng, ularning joylashuvi bir-biriga yaqinlashmadi, bu bizning yondashuvimiz ribosomaning ayrim mintaqalari/fraksiyalari uchun boyitishni ta'minlay olmaganligini ko'rsatadi. Biroq, qiziq tomoni shundaki, 2-klasterdagi katta subbirlik oqsillarining ulushi 1 va 3-klasterlarga qaraganda pastroq edi (Qo'shimcha 7D-rasm). Biz skelet mushak tolalarida o'zgargan stexiometriyaga ega oqsillar asosan ribosoma yuzasida joylashganligini kuzatdik (3E-rasm), bu ularning turli mRNK populyatsiyalaridagi ichki ribosoma kirish joyi (IRES) elementlari bilan o'zaro ta'sir qilish qobiliyatiga mos keladi va shu bilan selektiv tarjimani muvofiqlashtiradi. 40, 41 Bundan tashqari, skelet mushak tolalarida o'zgargan stexiometriyaga ega ko'plab oqsillar mRNK chiqish tunneli kabi funktsional mintaqalar yaqinida joylashgan edi (3F-rasm), ular ma'lum peptidlarning translyatsion uzayishi va to'xtashini tanlab tartibga soladi. 42 Xulosa qilib aytganda, bizning ma'lumotlarimiz skelet mushaklari ribosomalari oqsillarining stexiometriyasi heterojenlikni namoyon etishini va natijada skelet mushak tolalari o'rtasida farqlar paydo bo'lishini ko'rsatadi.
Keyin biz tez va sekin tortiladigan tola imzolarini aniqlashga va ularning transkripsiya regulyatsiyasi mexanizmlarini o'rganishga kirishdik. Ikkita ma'lumotlar to'plamida (1G-H va 4A-B rasmlar) UMAP tomonidan aniqlangan tez va sekin tortiladigan tola klasterlarini taqqoslab, transkriptomik va proteomik tahlillar mos ravishda 1366 va 804 ta turlicha ko'p xususiyatlarni aniqladi (4A-B rasmlar, Qo'shimcha ma'lumotlar to'plamlari 9-12). Biz sarkomerlar (masalan, tropomiozin va troponin), qo'zg'alish-qisqarish birlashishi (SERCA izoformlari) va energiya almashinuvi (masalan, ALDOA va CKB) bilan bog'liq imzolardagi kutilgan farqlarni kuzatdik. Bundan tashqari, oqsil ubikvitinatsiyasini tartibga soluvchi transkriptlar va oqsillar tez va sekin tortiladigan tolalarda (masalan, USP54, SH3RF2, USP28 va USP48) turlicha ifodalangan (4A-B rasmlar). Bundan tashqari, ilgari qo'zichoq mushak tolasi turlari bo'yicha differentsial ravishda ifodalanganligi ko'rsatilgan RP11-451G4.2 (DWORF) mikrobial oqsil geni 43 yurak mushaklarida 44, sekin skelet mushak tolalarida sezilarli darajada yuqori darajada tartibga solingan (4A-rasm). Xuddi shunday, individual tola darajasida metabolizm bilan bog'liq laktat dehidrogenaza izoformlari (LDHA va LDHB, 4C-rasm va 8A-qo'shimcha rasm)45,46 kabi ma'lum imzolarda, shuningdek, ilgari noma'lum bo'lgan tola turiga xos imzolarda (masalan, IRX3, USP54, USP28 va DPYSL3) sezilarli farqlar kuzatildi (4C-rasm). Transkriptomik va proteomik ma'lumotlar to'plamlari o'rtasida differentsial ravishda ifodalangan xususiyatlarning sezilarli darajada o'xshashligi (8B-rasm), shuningdek, asosan sarkomer xususiyatlarining aniqroq differentsial ifodalanishi bilan bog'liq bo'lgan buklanish o'zgarishi korrelyatsiyasi (8C-rasm) kuzatildi. Shunisi e'tiborga loyiqki, ba'zi imzolar (masalan, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) faqat proteomik darajada kuchli posttranskripsiya regulyatsiyasini ko'rsatdi va sekin/tez burish tolasi turiga xos ekspressiya profillariga ega edi (8C-qo'shimcha rasm).
1G–H rasmlarda bir xil ko'p qirrali yaqinlashuv va proyeksiya (UMAP) grafiklari orqali aniqlangan sekin va tez klasterlarni taqqoslaydigan A va B vulqon grafiklari. Rangli nuqtalar FDR < 0,05 da sezilarli darajada farq qiladigan transkriptlar yoki oqsillarni, quyuqroq nuqtalar esa log o'zgarishi > 1 da sezilarli darajada farq qiladigan transkriptlar yoki oqsillarni ifodalaydi. Ikki tomonlama statistik tahlil Benjamin-Xochberg sozlangan p qiymatlari (transkriptomika) bilan DESeq2 Wald testi yoki empirik Bayes tahlili bilan Limma chiziqli model usuli yordamida, so'ngra ko'p taqqoslashlar uchun Benjamin-Xochberg sozlamasi (proteomika) yordamida amalga oshirildi. C Sekin va tez tolalar orasidagi tanlangan differentsial ifodalangan genlar yoki oqsillarning imzo grafiklari. D Sezilarli darajada differentsial ifodalangan transkriptlar va oqsillarni boyitish tahlili. Bir-birining ustiga chiqadigan qiymatlar ikkala ma'lumotlar to'plamida ham boyitilgan, transkriptom qiymatlari faqat transkriptomda va proteom qiymatlari faqat proteomda boyitilgan. Statistik tahlil Benjamin-Xochberg sozlangan p-qiymatlari bilan clusterProfiler paketi yordamida amalga oshirildi. E. SCENIC tomonidan SCENIC tomonidan olingan regulyatorning o'ziga xoslik ballari va tola turlari orasidagi differentsial mRNK ifodasi asosida aniqlangan tola turiga xos transkripsiya omillari. F. Sekin va tez tolalar o'rtasida differentsial ifodalangan tanlangan transkripsiya omillarini profillash.
Keyin biz turlicha ifodalangan genlar va oqsillarning ortiqcha vakillik tahlilini o'tkazdik (4D-rasm, Qo'shimcha ma'lumotlar to'plami 13). Ikkala ma'lumotlar to'plami o'rtasida farq qiluvchi xususiyatlar uchun yo'lni boyitish kutilgan farqlarni, masalan, yog 'kislotasi β-oksidlanishi va keton metabolizmi jarayonlari (sekin tolalar), miofilament/mushak qisqarishi (mos ravishda tez va sekin tolalar) va uglevod katabolik jarayonlari (tez tolalar) kabi omillarni aniqladi. Serin/treonin oqsil fosfataza faolligi ham tez tolalarda yuqori bo'ldi, bu glikogen metabolizmini tartibga solishi ma'lum bo'lgan tartibga soluvchi va katalitik fosfataza subbirliklari (PPP3CB, PPP1R3D va PPP1R3A) kabi xususiyatlar tufayli yuzaga keldi (47) (Qo'shimcha rasmlar 8D–E). Tez tolalarga boy bo'lgan boshqa yo'llar proteomdagi qayta ishlash (P-) tanachalarini (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (8F-qo'shimcha rasm), transkripsiyadan keyingi tartibga solishda ishtirok etishi mumkin (48) va transkriptomdagi transkripsiya omili faolligini (SREBF1, RXRG, RORA) o'z ichiga olgan (8G-qo'shimcha rasm). Sekin tolalar oksidoreduktaza faolligi (BDH1, DCXR, TXN2) (8H-qo'shimcha rasm), amid bog'lanishi (CPTP, PFDN2, CRYAB) (8I-qo'shimcha rasm), hujayradan tashqari matritsa (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (8J-qo'shimcha rasm) va retseptor-ligand faolligi (FNDC5, SPX, NENF) bilan boyitilgan (8K-qo'shimcha rasm).
Sekin/tez mushak tolasi turi xususiyatlarining asosidagi transkripsiya regulyatsiyasini chuqurroq tushunish uchun biz SCENIC49 (Qo'shimcha ma'lumotlar to'plami 14) yordamida transkripsiya omillarini boyitish tahlilini o'tkazdik. Ko'pgina transkripsiya omillari tez va sekin mushak tolalari o'rtasida sezilarli darajada boyitilgan (4E-rasm). Bunga ilgari tez mushak tolasi rivojlanishi bilan bog'liq bo'lgan MAFA kabi transkripsiya omillari,50 shuningdek, ilgari mushak tolasi turiga xos gen dasturlari bilan bog'liq bo'lmagan bir nechta transkripsiya omillari kiradi. Ular orasida PITX1, EGR1 va MYF6 tez mushak tolalarida eng boyitilgan transkripsiya omillari bo'lgan (4E-rasm). Aksincha, ZSCAN30 va EPAS1 (shuningdek, HIF2A deb ham ataladi) sekin mushak tolalarida eng boyitilgan transkripsiya omillari bo'lgan (4E-rasm). Bunga muvofiq, MAFA tez mushak tolalariga mos keladigan UMAP mintaqasida yuqori darajalarda ifodalangan, EPAS1 esa teskari ifoda naqshiga ega edi (4F-rasm).
Ma'lum oqsil kodlovchi genlardan tashqari, inson rivojlanishi va kasalliklarini tartibga solishda ishtirok etishi mumkin bo'lgan ko'plab kodlamaydigan RNK biotiplari mavjud. 51, 52 Transkriptom ma'lumotlar to'plamlarida bir nechta kodlamaydigan RNKlar tola turiga xoslikni namoyon etadi (5A-rasm va Qo'shimcha ma'lumotlar to'plami 15), jumladan, sekin tolalar uchun juda xos bo'lgan va mitoxondrial miopatiyali bemorlarda mushaklarda kamayganligi haqida xabar berilgan LINC01405. 53 Aksincha, lnc-ERCC5-5 geniga mos keladigan RP11-255P5.3 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, tez tola turiga xoslikni namoyish etadi. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) va RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) skelet mushaklarining o'ziga xosligini namoyish etadi (9A–B qo'shimcha rasmlar) va ularning 1 Mb genomik mahallasida ma'lum qisqaruvchi genlar yo'q, bu ularning qo'shni qisqaruvchi genlarni tartibga solish o'rniga tola turlarini tartibga solishda ixtisoslashgan rol o'ynashini ko'rsatadi. LINC01405 va RP11-255P5.3 ning mos ravishda sekin/tez tola turiga xos ekspressiya profillari RNAscope yordamida tasdiqlandi (5B–C rasmlar).
A. Kodlanmagan RNK transkriptlari sekin va tez tortiladigan mushak tolalarida sezilarli darajada tartibga solinadi. B. LINC01405 va RP11-255P5.3 ning sekin va tez tortiladigan tola turiga xosligini ko'rsatuvchi vakillik RNKoskop tasvirlari. Masshtab chizig'i = 50 mkm. C. RNKoskop yordamida aniqlangan miyofiber turiga xos kodlanmagan RNK ekspressiyasini miqdorlash (mustaqil shaxslardan olingan n = 3 biopsiya, har bir shaxs ichidagi tez va sekin mushak tolalarini taqqoslash). Statistik tahlil ikki dumli Student t-testi yordamida amalga oshirildi. Katakcha grafiklarida mediana va birinchi va uchinchi kvartillar ko'rsatilgan, mo'ylovlar minimal va maksimal qiymatlarga ishora qiladi. D. De novo mikrobial oqsilni identifikatsiya qilish ish jarayoni (BioRender.com bilan yaratilgan). E. LINC01405_ORF408:17441:17358 mikrobial oqsili sekin skelet mushak tolalarida ifodalanadi (mustaqil ishtirokchilardan olingan n=5 biopsiya, har bir ishtirokchidagi tez va sekin mushak tolalarini taqqoslash). Statistik tahlil Limm chiziqli model usuli va empirik Bayes yondashuvi yordamida amalga oshirildi, so'ngra p-qiymatini sozlash bilan ko'p marta taqqoslash uchun Benjamini-Xochberg usuli qo'llanildi. Katakcha grafiklarida mediana, birinchi va uchinchi kvartillar ko'rsatilgan, mo'ylovlar esa maksimal/minimal qiymatlarga ishora qiladi.
Yaqinda o'tkazilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ko'plab taxminiy kodlanmagan transkriptlar transkripsiyalangan mikrobial oqsillarni kodlaydi, ularning ba'zilari mushaklar faoliyatini tartibga soladi. 44, 55 Potensial tola turiga xos bo'lgan mikrobial oqsillarni aniqlash uchun biz 1000 tolali proteom ma'lumotlar to'plamimizda 1000 tolali transkriptom ma'lumotlar to'plamida topilgan kodlanmagan transkriptlar ketma-ketligini (n = 305) o'z ichiga olgan maxsus FASTA faylidan foydalanib qidirdik (5D-rasm). Biz 22 xil transkriptdan 197 ta mikrobial oqsilni aniqladik, ulardan 71 tasi sekin va tez skelet mushak tolalari o'rtasida farqli ravishda tartibga solingan (9C-qo'shimcha rasm va 16-qo'shimcha ma'lumotlar to'plami). LINC01405 uchun uchta mikrobial oqsil mahsuloti aniqlandi, ulardan biri transkriptiga o'xshash sekin tolaga xoslikni ko'rsatdi (5E-rasm va 9D-qo'shimcha rasm). Shunday qilib, biz LINC01405 ni sekin skelet mushak tolalari uchun xos bo'lgan mikrobial oqsilni kodlovchi gen sifatida aniqladik.
Biz individual mushak tolalarini keng ko'lamli proteomik tavsiflash uchun keng qamrovli ish jarayonini ishlab chiqdik va sog'lom holatlarda tola heterojenligining regulyatorlarini aniqladik. Biz ushbu ish jarayonini nemalin miopatiyalarining skelet mushak tolasining heterojenligiga qanday ta'sir qilishini tushunish uchun qo'lladik. Nemalin miopatiyalari mushaklarning kuchsizlanishiga olib keladigan va ta'sirlangan bolalarda nafas olish qiyinlishuvi, skolioz va oyoq-qo'llarning cheklangan harakatchanligi kabi bir qator asoratlar bilan namoyon bo'ladigan irsiy mushak kasalliklaridir. 19,20 Odatda, nemalin miopatiyalarida aktin alfa 1 (ACTA1) kabi genlardagi patogen variantlar sekin tortiladigan tola miofiber tarkibining ustunligiga olib keladi, garchi bu ta'sir heterojen bo'lsa ham. E'tiborga molik istisnolardan biri bu tez tolalar ustunlik qiladigan troponin T1 nemalin miopatiyasi (TNNT1). Shunday qilib, nemalin miopatiyalarida kuzatiladigan skelet mushak tolasining disregulyatsiyasi asosidagi heterojenlikni yaxshiroq tushunish ushbu kasalliklar va miofiber turi o'rtasidagi murakkab bog'liqlikni aniqlashga yordam beradi.
Sog'lom nazorat guruhi bilan solishtirganda (guruhda n=3), ACTA1 va TNNT1 genlarida mutatsiyaga uchragan nemalin miyopatiyasi bilan og'rigan bemorlardan ajratilgan miyofiberlar sezilarli miyofiber atrofiyasi yoki distrofiyasini ko'rsatdi (6A-rasm, 3-qo'shimcha jadval). Bu mavjud materialning cheklangan miqdori tufayli proteomik tahlil uchun jiddiy texnik qiyinchiliklarni keltirib chiqardi. Shunga qaramay, biz 272 skelet miyofiberida 2485 ta oqsilni aniqlay oldik. Har bir tola uchun kamida 1000 ta miqdoriy oqsilni filtrlagandan so'ng, 250 ta tola keyingi bioinformatik tahlilga tortildi. Filtrlangandan so'ng, har bir tola uchun o'rtacha 1573 ± 359 ta oqsil miqdoriy jihatdan aniqlandi (10A-rasm, Qo'shimcha ma'lumotlar to'plamlari 17–18). Shunisi e'tiborga loyiqki, tola hajmining sezilarli darajada kamayishiga qaramay, nemalin miyopatiyasi bilan og'rigan bemorlar namunalarining proteom chuqurligi ozgina kamaydi. Bundan tashqari, ushbu ma'lumotlarni o'zimizning FASTA fayllarimiz (kodlanmagan transkriptlarni ham qo'shgan holda) yordamida qayta ishlash bizga nemalin miyopatiyasi bilan og'rigan bemorlarning skelet miyofiberlaridagi beshta mikrobial oqsilni aniqlash imkonini berdi (Qo'shimcha ma'lumotlar to'plami 19). Proteomning dinamik diapazoni ancha kengroq edi va nazorat guruhidagi umumiy oqsillar avvalgi 1000 ta tolali proteom tahlili natijalari bilan yaxshi bog'liq edi (Qo'shimcha 10B-C rasm).
A. ACTA1 va TNNT1 nemalin miyopatiyalarida (NM) MYH asosida tola atrofiyasi yoki distrofiyasi va turli tola turlarining ustunligini ko'rsatuvchi mikroskopik tasvirlar. Masshtab chizig'i = 100 mkm. ACTA1 va TNNT1 bemorlarida bo'yashning takrorlanishini ta'minlash uchun vakillik tasvirlarini tanlashdan oldin uchta bemor biopsiyasi ikki-uch marta (har bir holatda to'rtta bo'lim) bo'yalgan. B. MYH asosida ishtirokchilarda tola turi nisbatlari. C. Nemalin miyopatiyalari va nazorat guruhidagi bemorlarda skelet mushak tolalarining asosiy komponent tahlili (PCA) grafigi. D. Nemalin miyopatiyalari va nazorat guruhidagi bemorlarning skelet mushak tolalari 2-rasmda tahlil qilingan 1000 ta toladan aniqlangan PCA grafigiga proyeksiyalangan. Masalan, ACTA1 va TNNT1 nemalin miyopatiyalari va nazorat guruhidagi ishtirokchilar o'rtasidagi va ACTA1 va TNNT1 nemalin miyopatiyalari bo'lgan ishtirokchilar o'rtasidagi farqlarni taqqoslaydigan vulqon grafiglari. Rangli doiralar π < 0,05 da sezilarli darajada farq qiladigan oqsillarni, to'q nuqtalar esa FDR < 0,05 da sezilarli darajada farq qiladigan oqsillarni bildiradi. Statistik tahlil Limma chiziqli model usuli va empirik Bayes usullari yordamida amalga oshirildi, so'ngra Benjamin-Xochberg usuli yordamida ko'p marta taqqoslash uchun p-qiymatini sozlash amalga oshirildi. H. Butun proteom bo'ylab va 1 va 2A tipdagi tolalarda sezilarli darajada farqlanadigan oqsillarni boyitish tahlili. Statistik tahlil clusterProfiler paketi va Benjamin-Xochberg tomonidan sozlangan p-qiymatlari yordamida amalga oshirildi. I, J. Hujayradan tashqari matritsa va mitoxondrial gen ontologiyasi (GO) atamalari bilan ranglangan asosiy komponent tahlili (PCA) grafiklari.
Nemalin miyopatiyalari skelet mushaklarida MYH ifodalovchi miyofiber turlarining ulushiga ta'sir qilishi mumkinligi sababli,19,20 biz avval nemalin miyopatiyasi bo'lgan bemorlar va nazorat guruhida MYH ifodalovchi miyofiber turlarini tekshirdik. Biz miyofiber turini 1000 miyofiber tahlili uchun ilgari tasvirlangan xolis usul yordamida aniqladik (Qo'shimcha 10D-E rasmlar) va yana sof 2X miyofiberlarni aniqlay olmadik (6B-rasm). Biz nemalin miyopatiyalarining miyofiber turiga heterojen ta'sirini kuzatdik, chunki ACTA1 mutatsiyalari bo'lgan ikkita bemorda 1-turdagi miyofiberlarning ulushi oshgan, TNNT1 nemalin miyopatiyasi bo'lgan ikkita bemorda esa 1-turdagi miyofiberlarning ulushi kamaygan (6B-rasm). Darhaqiqat, MYH2 va tez troponin izoformlarining (TNNC2, TNNI2 va TNNT3) ifodasi ACTA1-nemalin miyopatiyalarida kamaygan, MYH7 ifodasi esa TNNT1-nemalin miyopatiyalarida kamaygan (Qo'shimcha 11A-rasm). Bu nemalin miyopatiyalarida heterojen miyofiber turini almashtirish haqidagi avvalgi xabarlarga mos keladi.19,20 Biz bu natijalarni immunohistokimyoviy usul bilan tasdiqladik va ACTA1-nemalin miyopatiyasi bilan og'rigan bemorlarda 1-turdagi miyofiberlar ustunlik qilishini, TNNT1-nemalin miyopatiyasi bilan og'rigan bemorlarda esa teskari naqshga ega ekanligini aniqladik (6A-rasm).
Bir tolali proteom darajasida ACTA1 va TNNT1 nemalin miyopatiyasi bilan og'rigan bemorlarning skelet mushak tolalari ko'pchilik nazorat tolalari bilan klasterlangan bo'lib, TNNT1 nemalin miyopatiyasi tolalari odatda eng ko'p ta'sirlangan (6C-rasm). Bu, ayniqsa, har bir bemor uchun soxta shishirilgan tolalarning asosiy komponent tahlili (PCA) grafiklarini tuzishda yaqqol ko'rinib turdi, bunda TNNT1 nemalin miyopatiyasi bilan og'rigan 2 va 3 bemorlar nazorat namunalaridan eng uzoqda ko'rindi (Qo'shimcha 11B-rasm, Qo'shimcha ma'lumotlar to'plami 20). Miyopatiya bilan og'rigan bemorlarning tolalari sog'lom tolalar bilan qanday taqqoslanishini yaxshiroq tushunish uchun biz sog'lom kattalar ishtirokchilaridan 1000 ta tolaning proteomik tahlilidan olingan batafsil ma'lumotlardan foydalandik. Biz miyopatiya ma'lumotlar to'plamidan (ACTA1 va TNNT1 nemalin miyopatiyasi bilan og'rigan bemorlar va nazorat guruhi) tolalarni 1000 ta tolali proteomik tahlildan olingan PCA grafikasiga proektsiya qildik (6D-rasm). Nazorat tolalarida PC2 bo'ylab MYH tola turlarining taqsimlanishi 1000 ta tolali proteomik tahlildan olingan tola taqsimotiga o'xshash edi. Biroq, nemalin miopati bemorlaridagi ko'pgina tolalar, ularning asl MYH tola turidan qat'i nazar, sog'lom tez tortiladigan tolalar bilan bir-biriga mos keladigan PC2 ga pastga siljidi. Shunday qilib, ACTA1 nemalin miopati bilan og'rigan bemorlar MYH asosidagi usullar yordamida miqdoriy jihatdan aniqlanganda 1-turdagi tolalarga siljish ko'rsatgan bo'lsalar-da, ACTA1 nemalin miopati va TNNT1 nemalin miopati skelet mushak tolasi proteomini tez tortiladigan tolalarga siljitdi.
Keyin biz har bir bemor guruhini sog'lom nazorat guruhi bilan to'g'ridan-to'g'ri taqqosladik va mos ravishda ACTA1 va TNNT1 nemalin miyopatiyalarida 256 va 552 ta differentsial ifodalangan oqsillarni aniqladik (6E-G-rasm va 11C-qo'shimcha rasm, 21-qo'shimcha ma'lumotlar to'plami). Genlarni boyitish tahlili mitoxondrial oqsillarning muvofiqlashtirilgan pasayishini ko'rsatdi (6H-I-rasm, 22-qo'shimcha ma'lumotlar to'plami). Ajablanarlisi shundaki, ACTA1 va TNNT1 nemalin miyopatiyalarida tola turlarining differentsial ustunligiga qaramay, bu pasayish MYH asosidagi tola turidan butunlay mustaqil edi (6H-rasm va 11D-I-qo'shimcha rasmlar, 23-qo'shimcha ma'lumotlar to'plami). ACTA1 yoki TNNT1 nemalin miyopatiyalarida uchta mikrobial oqsil ham tartibga solingan. Ushbu mikroproteinlardan ikkitasi, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (LINC00598 yoki Lnc-FOXO1 nomi bilan ham tanilgan) va ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), faqat 1-turdagi miofibralarda differentsial ko'plikni ko'rsatdi. ENSG00000215483_TR14_ORF67 ilgari hujayra siklini boshqarishda rol o'ynashi haqida xabar berilgan edi. 56 Boshqa tomondan, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798 ga mos keladi) sog'lom nazorat guruhiga nisbatan ACTA1-nemalin miopatiyasida 1 va 2A tipdagi miofibralarda ko'paygan (Qo'shimcha 12A-rasm, Qo'shimcha ma'lumotlar to'plami 24). Aksincha, ribosomal oqsillarga nemalin miyopatiyasi deyarli ta'sir qilmadi, garchi RPS17 ACTA1 nemalin miyopatiyasida pasaygan bo'lsa ham (6E-rasm).
Boyitish tahlili shuningdek, ACTA1 va TNNT1 nemalin miyopatiyalarida immun tizimi jarayonlarining yuqori regulyatsiyasini aniqladi, shu bilan birga TNNT1 nemalin miyopatiyasida hujayra adgeziyasi ham oshdi (6H-rasm). Ushbu hujayradan tashqari omillarning boyitilishi PC1 va PC2 da PCA ni salbiy yo'nalishda (ya'ni eng ko'p ta'sirlangan tolalar tomon) siljituvchi hujayradan tashqari matritsa oqsillari bilan aks ettirildi (6J-rasm). Ikkala bemor guruhida ham immun reaksiyalarida va sarkolemmal ta'mirlash mexanizmlarida ishtirok etadigan hujayradan tashqari oqsillarning, masalan, anneksinlar (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 va ularning o'zaro ta'sir qiluvchi oqsili S100A1159 (Qo'shimcha rasmlar 12B–C). Bu jarayon ilgari mushak distrofiyalarida kuchaygani haqida xabar berilgan edi60, ammo bizning ma'lumotimizga ko'ra, ilgari nemalin miyopatiyalari bilan bog'liq bo'lmagan. Ushbu molekulyar mexanizmning normal ishlashi jarohatlardan keyin sarkolemmal ta'mirlash va yangi hosil bo'lgan miyositlarning miyofiberlar bilan birlashishi uchun zarurdir58,61. Shunday qilib, ikkala bemor guruhida ham bu jarayonning faolligining ortishi miyofiber beqarorligi tufayli kelib chiqadigan shikastlanishga reparativ javobni ko'rsatadi.
Har bir nemalin miopatiyasining ta'siri yaxshi korrelyatsiyalangan (r = 0.736) va oqilona o'xshashlikni ko'rsatdi (11A-B qo'shimcha rasmlar), bu ACTA1 va TNNT1 nemalin miopatiyasining proteomga o'xshash ta'sir ko'rsatishini ko'rsatadi. Biroq, ba'zi oqsillar faqat ACTA1 yoki TNNT1 nemalin miopatiyasida tartibga solingan (11A va C qo'shimcha rasmlar). Profibrotik MFAP4 oqsili TNNT1 nemalin miopatiyasidagi eng yuqori darajada tartibga solingan oqsillardan biri edi, ammo ACTA1 nemalin miopatiyasida o'zgarishsiz qoldi. HOX gen transkripsiyasini tartibga solish uchun mas'ul bo'lgan PAF1C kompleksining komponenti bo'lgan SKIC8 TNNT1 nemalin miopatiyasida pasaygan, ammo ACTA1 nemalin miopatiyasida ta'sirlanmagan (11A qo'shimcha rasm). ACTA1 va TNNT1 nemalin miopatiyasini to'g'ridan-to'g'ri taqqoslash TNNT1 nemalin miopatiyasida mitoxondriyal oqsillarning ko'proq kamayishi va immun tizimi oqsillarining ko'payishini aniqladi (6G-H-rasm va 11C va 11H-I qo'shimcha rasmlar). Bu ma'lumotlar TNNT1 nemalin miopatiyasida TNNT1 nemalin miopatiyasiga nisbatan kuzatilgan katta atrofiya/distrofiya bilan mos keladi (6A-rasm), bu TNNT1 nemalin miopatiyasi kasallikning yanada og'ir shaklini ifodalashini ko'rsatadi.
Nemalin miyopatiyasining kuzatilgan ta'siri butun mushak darajasida saqlanib qolishini baholash uchun biz TNNT1 nemalin miyopatiyasi bemorlarining bir xil kohortasidan olingan mushak biopsiyalarining ommaviy proteomik tahlilini o'tkazdik va ularni nazorat guruhi (har bir guruh uchun n=3) bilan taqqosladik (13A-qo'shimcha rasm, 25-qo'shimcha ma'lumotlar to'plami). Kutilganidek, nazorat guruhi asosiy komponent tahlilida chambarchas bog'liq edi, TNNT1 nemalin miyopatiyasi bemorlari esa bitta tola tahlilida kuzatilganiga o'xshash yuqori namunalararo o'zgaruvchanlikni namoyish etdilar (13B-qo'shimcha rasm). Ommaviy tahlil individual tolalarni taqqoslash orqali ta'kidlangan differentsial ifodalangan oqsillarni (13C-qo'shimcha rasm, 26-qo'shimcha ma'lumotlar to'plami) va biologik jarayonlarni (13D-qo'shimcha rasm, 27-qo'shimcha ma'lumotlar to'plami) takrorladi, ammo turli tola turlarini farqlash qobiliyatini yo'qotdi va tolalar bo'ylab heterojen kasallik ta'sirini hisobga olmadi.
Birgalikda, bu ma'lumotlar bitta miofiberli proteomika immunoblotting kabi maqsadli usullar bilan aniqlab bo'lmaydigan klinik biologik xususiyatlarni aniqlay olishini ko'rsatadi. Bundan tashqari, bu ma'lumotlar fenotipik moslashuvni tavsiflash uchun faqat aktin tolasi tiplashdan (MYH) foydalanishning cheklovlarini ta'kidlaydi. Darhaqiqat, tola turini almashtirish aktin va troponin nemalin miopatiyalari o'rtasida farq qilsa-da, ikkala nemalin miopatiyasi ham MYH tolasi tiplashini skelet mushak tolasi metabolizmidan tezroq va kamroq oksidlovchi mushak proteomiga qarab ajratadi.
Hujayra heterojenligi to'qimalarning xilma-xil talablarini qondirish uchun juda muhimdir. Skelet mushaklarida bu ko'pincha kuch ishlab chiqarish va charchoqning turli darajalari bilan tavsiflangan tola turlari sifatida ta'riflanadi. Biroq, bu skelet mushak tolasi o'zgaruvchanligining faqat kichik bir qismini tushuntirib berishi aniq, bu ilgari o'ylanganidan ancha o'zgaruvchan, murakkab va ko'p qirrali. Texnologik yutuqlar endi skelet mushak tolalarini tartibga soluvchi omillarga oydinlik kiritdi. Darhaqiqat, bizning ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, 2X turdagi tolalar alohida skelet mushak tolasi kichik turi bo'lmasligi mumkin. Bundan tashqari, biz metabolik oqsillarni, ribosomal oqsillarni va hujayra bilan bog'liq oqsillarni skelet mushak tolasi heterojenligining asosiy determinantlari sifatida aniqladik. Proteomik ish oqimini nematod miopatiyasi bilan og'rigan bemor namunalariga qo'llash orqali biz MYH asosidagi tola tiplash skelet mushaklari heterojenligini to'liq aks ettirmasligini, ayniqsa tizim buzilganda ekanligini ko'rsatdik. Darhaqiqat, MYH asosidagi tola turidan qat'i nazar, nematod miopatiyasi tezroq va kamroq oksidlovchi tolalarga o'tishga olib keladi.
Skelet mushak tolalari 19-asrdan beri tasniflanib kelinmoqda. Yaqinda omiks tahlillari bizga turli xil MYH tola turlarining ifoda profillarini va ularning turli stimullarga javoblarini tushunishga imkon berdi. Bu yerda ta'riflanganidek, omiks yondashuvlari an'anaviy antikorga asoslangan usullarga qaraganda tola turi markerlarini miqdoriy aniqlashda yuqori sezgirlikka ega, skelet mushak tolasi turini aniqlash uchun bitta (yoki bir nechta) markerni miqdoriy aniqlashga tayanmasdan. Biz qo'shimcha transkriptomik va proteomik ish oqimlaridan foydalandik va natijalarni inson skelet mushak tolalarida tola heterojenligining transkripsiya va transkripsiyadan keyingi regulyatsiyasini o'rganish uchun birlashtirdik. Ushbu ish oqimi sog'lom yosh erkaklar kohortamizning vastus lateralis qismidagi oqsil darajasida sof 2X tipidagi tolalarni aniqlay olmaganimizga olib keldi. Bu sog'lom vastus lateralis qismidagi <1% sof 2X tolalarni aniqlagan oldingi bitta tolali tadqiqotlar bilan mos keladi, garchi bu kelajakda boshqa mushaklarda tasdiqlanishi kerak. mRNK darajasida deyarli sof 2X tolalarini aniqlash va oqsil darajasida faqat aralash 2A/2X tolalari o'rtasidagi tafovut hayratlanarli. MYH izoform mRNK ifodasi sirkadiyalik emas,67 bu biz RNK darajasida sof 2X tolalarida MYH2 boshlanish signalini "o'tkazib yuborganimiz" ehtimoldan yiroq ekanligini ko'rsatadi. Mumkin bo'lgan bitta tushuntirish, garchi sof gipotetik bo'lsa-da, MYH izoformlari orasidagi oqsil va/yoki mRNK barqarorligidagi farqlar bo'lishi mumkin. Darhaqiqat, hech qanday tez tola biron bir MYH izoformi uchun 100% sof emas va MYH1 mRNK ifoda darajasining 70-90% oralig'ida bo'lishi oqsil darajasida teng MYH1 va MYH2 ko'pligiga olib keladimi yoki yo'qmi noma'lum. Biroq, butun transkriptom yoki proteomni ko'rib chiqishda, klaster tahlili aniq MYH tarkibidan qat'i nazar, sekin va tez skelet mushak tolalarini ifodalovchi faqat ikkita alohida klasterni ishonchli tarzda aniqlashi mumkin. Bu odatda faqat ikkita alohida miyonuklear klasterni aniqlaydigan bitta yadroli transkriptomik yondashuvlardan foydalangan holda tahlillarga mos keladi. 68, 69, 70 Bundan tashqari, oldingi proteomik tadqiqotlar 2X tipdagi tolalarni aniqlagan bo'lsa-da, bu tolalar qolgan tezkor tolalardan alohida klasterlanmaydi va MYH ga asoslangan boshqa tola turlariga nisbatan juda oz miqdordagi turli xil oqsillarni ko'rsatadi. 14 Bu natijalar biz 20-asr boshlarida inson skelet mushak tolalarini MYH ga asoslangan uchta alohida sinfga emas, balki metabolik va qisqarish xususiyatlariga qarab ikkita klasterga ajratgan mushak tolalarini tasniflash nuqtai nazariga qaytishimiz kerakligini ko'rsatadi. 63
Eng muhimi, miyofiber heterojenligi bir nechta o'lchovlar bo'yicha ko'rib chiqilishi kerak. Avvalgi "omika" tadqiqotlari shu yo'nalishga ishora qilib, skelet mushak tolalari alohida klasterlar hosil qilmasligini, balki kontinuum bo'ylab joylashganligini ko'rsatgan. 11, 13, 14, 64, 71 Bu yerda biz skelet mushaklarining qisqarish va metabolik xususiyatlaridagi farqlardan tashqari, miyofiberlarni hujayra-hujayra o'zaro ta'siri va tarjima mexanizmlari bilan bog'liq xususiyatlar bilan farqlash mumkinligini ko'rsatamiz. Darhaqiqat, biz skelet mushak tolalarida sekin va tez tola turlaridan mustaqil ravishda heterojenlikka hissa qo'shadigan ribosoma heterojenligini topdik. Sekin va tez tola turidan mustaqil bo'lgan bu sezilarli miyofiber heterojenligining asosiy sababi noma'lumligicha qolmoqda, ammo u ma'lum kuchlar va yuklarga optimal javob beradigan mushak tolalari ichidagi ixtisoslashgan fazoviy tashkilotga,72 mushak mikro muhitidagi boshqa hujayra turlari bilan ixtisoslashgan hujayrali yoki organga xos aloqaga73,74,75 yoki individual miyofiberlar ichidagi ribosoma faolligidagi farqlarga ishora qilishi mumkin. Darhaqiqat, ribosomal geteroplazmiya, RPL3 va RPL3L ning paralog almashtirishi orqali yoki rRNK ning 2′O-metillanishi darajasida, skelet mushaklari gipertrofiyasi bilan bog'liqligi ko'rsatilgan76,77. Ko'p omli va fazoviy qo'llanmalar individual miofibralarning funktsional tavsifi bilan birgalikda mushak biologiyasini ko'p omli darajada tushunishimizni yanada rivojlantiradi78.
Nemalin miopatiyalari bo'lgan bemorlarning yakka miofibralarining proteomlarini tahlil qilish orqali biz skelet mushaklarining klinik patofiziologiyasini aniqlash uchun yakka miofibra proteomikasining foydaliligi, samaradorligi va qo'llanilishini ham namoyish etdik. Bundan tashqari, ish oqimimizni global proteomik tahlil bilan taqqoslash orqali biz yakka miofibra proteomikasi global to'qima proteomikasi bilan bir xil ma'lumot chuqurligini berishini va bu chuqurlikni tolalararo heterojenlik va miofibra turini hisobga olish orqali kengaytirishini ko'rsata oldik. ACTA1 va TNNT1 nemalin miopatiyalarida sog'lom nazorat guruhiga nisbatan kuzatilgan tola turi nisbatidagi kutilgan (o'zgaruvchan bo'lsa ham) farqlarga qo'shimcha ravishda,19 biz MYH vositachiligidagi tola turini almashtirishdan mustaqil ravishda oksidlovchi va hujayradan tashqari qayta qurishni ham kuzatdik. Fibroz ilgari TNNT1 nemalin miyopatiyalarida qayd etilgan edi.19 Biroq, bizning tahlilimiz ushbu topilmaga asoslanib, ACTA1 va TNNT1 nemalin miyopatiyalari bo'lgan bemorlarning miyofiberlarida sarkolemmal ta'mirlash mexanizmlarida ishtirok etadigan annexinlar kabi hujayradan tashqari ajralib chiqadigan stress bilan bog'liq oqsillarning ko'payganligini ham aniqlaydi.57,58,59 Xulosa qilib aytganda, nemalin miyopatiyasi bo'lgan bemorlarning miyofiberlarida annexin darajasining oshishi og'ir atrofik miyofiberlarni ta'mirlashga hujayrali javobni ifodalashi mumkin.
Garchi ushbu tadqiqot bugungi kunga qadar odamlarning eng katta bitta tolali butun mushak-omika tahlilini ifodalasa-da, u cheklovlarsiz emas. Biz skelet mushak tolalarini ishtirokchilarning nisbatan kichik va bir xil namunasidan va bitta mushakdan (vastus lateralis) ajratib oldik. Shuning uchun, mushak turlari bo'yicha va mushak fiziologiyasining eng chekka nuqtalarida ma'lum tola populyatsiyalarining mavjudligini istisno qilib bo'lmaydi. Masalan, yuqori malakali sprinterlarda va/yoki kuch sportchilarida79 yoki mushaklarning harakatsizligi davrida66,80 ultratez tolalarning bir qismi (masalan, sof 2X tolalar) paydo bo'lish ehtimolini istisno qilib bo'lmaydi. Bundan tashqari, ishtirokchilarning cheklangan namunaviy hajmi bizga tola heterojenligidagi jins farqlarini o'rganishga to'sqinlik qildi, chunki tola turi nisbatlari erkaklar va ayollar o'rtasida farq qilishi ma'lum. Bundan tashqari, biz bir xil mushak tolalari yoki bir xil ishtirokchilarning namunalarida transkriptomik va proteomik tahlillarni o'tkaza olmadik. Biz va boshqalar juda past namunaviy kirishga erishish uchun omics tahlilidan foydalangan holda bitta hujayrali va bitta miofiber tahlillarini optimallashtirishda davom etar ekanmiz (bu yerda mitoxondrial miopatiya bilan og'rigan bemorlarning tolalarini tahlil qilishda ko'rsatilganidek), bitta mushak tolalari ichida ko'p omics (va funktsional) yondashuvlarni birlashtirish imkoniyati aniq bo'ladi.
Umuman olganda, bizning ma'lumotlarimiz skelet mushaklari heterojenligining transkripsiya va transkripsiyadan keyingi omillarini aniqlaydi va tushuntiradi. Xususan, biz skelet mushaklari fiziologiyasida klassik MYH asosidagi tola turlarining ta'rifi bilan bog'liq bo'lgan uzoq vaqtdan beri mavjud bo'lgan dogmaga qarshi chiqadigan ma'lumotlarni taqdim etamiz. Biz munozarani yangilashga va oxir-oqibat skelet mushak tolalari tasnifi va heterojenligi haqidagi tushunchamizni qayta ko'rib chiqishga umid qilamiz.
O'n to'rt nafar kavkazlik ishtirokchi (12 erkak va 2 ayol) ushbu tadqiqotda ishtirok etishga ixtiyoriy ravishda rozilik berishdi. Tadqiqot Gent universiteti kasalxonasining axloq qo'mitasi (BC-10237) tomonidan ma'qullandi, 2013 yilgi Xelsinki deklaratsiyasiga muvofiq bo'ldi va ClinicalTrials.gov (NCT05131555) saytida ro'yxatdan o'tkazildi. Ishtirokchilarning umumiy xususiyatlari 1-qo'shimcha jadvalda keltirilgan. Og'zaki va yozma ravishda xabardor qilingan rozilikni olgandan so'ng, ishtirokchilar tadqiqotga yakuniy kiritilishdan oldin tibbiy ko'rikdan o'tdilar. Ishtirokchilar yosh (22–42 yosh), sog'lom (tibbiy holati yo'q, chekish tarixi yo'q) va o'rtacha darajada jismoniy faol edilar. Maksimal kislorod qabul qilish avval tasvirlanganidek, jismoniy tayyorgarlikni baholash uchun pog'onali ergometr yordamida aniqlandi. 81
Mushak biopsiyasi namunalari dam olish holatida va och qoringa uch marta, 14 kunlik oraliq bilan to'plandi. Ushbu namunalar kengroq tadqiqotning bir qismi sifatida to'planganligi sababli, ishtirokchilar biopsiyadan 40 daqiqa oldin platsebo (laktoza), H1 retseptorlari antagonisti (540 mg feksofenadin) yoki H2 retseptorlari antagonisti (40 mg famotidin) iste'mol qilishdi. Biz ilgari ushbu gistamin retseptorlari antagonistlari dam olish holatidagi skelet mushaklarining jismoniy holatiga ta'sir qilmasligini ko'rsatgan edik81 va sifat nazorati jadvallarimizda holat bilan bog'liq klasterlash kuzatilmadi (3 va 6-qo'shimcha rasmlar). Har bir tajriba kunidan 48 soat oldin standartlashtirilgan parhez (41,4 kkal/kg tana vazni, 5,1 g/kg tana vazni uglevod, 1,4 g/kg tana vazni oqsili va 1,6 g/kg tana vazni yog'i) saqlandi va tajriba kuni ertalab standartlashtirilgan nonushta (1,5 g/kg tana vazni uglevod) iste'mol qilindi. Mahalliy og'riqsizlantirish ostida (epinefrinsiz 0,5 ml 1% lidokain), Bergström aspiratsiyasi yordamida vastus lateralis mushagidan mushak biopsiyalari olindi.82 Mushak namunalari darhol RNKga joylashtirildi va qo'lda tolalar ajratilgunga qadar (3 kungacha) 4°C da saqlandi.
Yangi ajratilgan miofiber bog'lamlari kultura idishidagi yangi RNAlater muhitiga o'tkazildi. Keyin individual miofiberlar stereomikroskop va ingichka pinset yordamida qo'lda ajratildi. Har bir biopsiyadan yigirma beshta tola ajratildi, biopsiyaning turli sohalaridan tolalarni tanlashga alohida e'tibor berildi. Ajratilgandan so'ng, har bir tola keraksiz oqsillar va DNKni olib tashlash uchun proteinaza K va DNase fermentlarini o'z ichiga olgan 3 mkl lizis buferiga (SingleShot Cell Lisis Kit, Bio-Rad) muloyimlik bilan botirildi. Keyin hujayra lizisi va oqsil/DNKni olib tashlash qisqa vaqt ichida vortekslash, suyuqlikni mikrotsentrifugada aylantirish va xona haroratida (10 daqiqa) inkubatsiya qilish orqali boshlandi. Keyin lizat termal siklerda (T100, Bio-Rad) 37°C da 5 daqiqa, 75°C da 5 daqiqa inkubatsiya qilindi va keyin darhol -80°C da keyingi ishlov berilgunga qadar saqlandi.
Illumina bilan mos keladigan poliadenillangan RNK kutubxonalari 2 µl miyofiber lizatdan QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen) yordamida tayyorlandi. Batafsil usullarni ishlab chiqaruvchining qo'llanmasida topish mumkin. Jarayon teskari transkripsiya orqali birinchi qatorli kDNK sintezi bilan boshlanadi, bu jarayonda namunalarni birlashtirishni ta'minlash va keyingi ishlov berish paytida texnik o'zgaruvchanlikni kamaytirish uchun noyob molekulyar identifikatorlar (UMI) va namunaga xos i1 shtrix-kodlari kiritiladi. Keyin 96 ta miyofiberdan olingan kDNK birlashtiriladi va magnit boncuklar bilan tozalanadi, shundan so'ng RNK olib tashlanadi va tasodifiy primerlar yordamida ikkinchi qatorli sintez amalga oshiriladi. Kutubxona magnit boncuklar bilan tozalanadi, boncuklarga xos i5/i7 teglari qo'shiladi va PZR kuchaytiriladi. Yakuniy tozalash bosqichi Illumina bilan mos keladigan kutubxonalarni hosil qiladi. Har bir kutubxona fondining sifati yuqori sezgirlikdagi kichik fragmentli DNK tahlil to'plami (Agilent Technologies, DNF-477-0500) yordamida baholandi.
Qubit miqdorini aniqlash asosida, hovuzlar ekvimolyar konsentratsiyalarda (2 nM) qo'shimcha ravishda birlashtirildi. Keyin hosil bo'lgan hovuz NovaSeq 6000 asbobida standart rejimda NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nukleotidlar) yordamida 2 nM yuklama (4% PhiX) bilan ketma-ketlashtirildi.
Bizning quvur liniyasi Lexogen'ning QuantSeq Pool ma'lumotlar tahlili quvur liniyasiga asoslangan (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Ma'lumotlar avval i7/i5 indeksiga asoslangan holda bcl2fastq2 (v2.20.0) bilan demultiplekslashtirildi. Keyin 2-o'qish i1 namunaviy shtrix-kodiga asoslangan holda idemux (v0.1.6) bilan demultiplekslashtirildi va UMI ketma-ketliklari umi_tools (v1.0.1) yordamida ajratib olindi. Keyin o'qishlar qisqa o'qishlarni (<20 uzunlikdagi) yoki faqat adapter ketma-ketliklaridan iborat o'qishlarni olib tashlash uchun cutadapt (v3.4) bilan bir necha bosqichda kesildi. Keyin o'qishlar STAR (v2.6.0c) yordamida inson genomiga moslashtirildi va BAM fayllari SAMtools (v1.11) yordamida indekslandi. Dublikat o'qishlar umi_tools (v1.0.1) yordamida olib tashlandi. Nihoyat, hizalanishni hisoblash Subread (v2.0.3) da featureCounts yordamida amalga oshirildi. Sifat nazorati quvur liniyasining bir nechta oraliq bosqichlarida FastQC (v0.11.9) yordamida amalga oshirildi.
Barcha keyingi bioinformatikani qayta ishlash va vizualizatsiya qilish ishlari asosan Seurat (v4.4.0) ish jarayonidan foydalangan holda R (v4.2.3) da amalga oshirildi. 83 Shuning uchun individual UMI qiymatlari va metama'lumotlar matritsalari Seurat obyektlariga aylantirildi. Barcha tolalarning 30% dan kamrog'ida ifodalangan genlar olib tashlandi. Past sifatli namunalar 1000 ta UMI qiymatlari va 1000 ta aniqlangan genlarning minimal chegarasi asosida olib tashlandi. Oxir-oqibat, 925 ta tola barcha sifat nazorati filtrlash bosqichlaridan o'tdi. UMI qiymatlari Seurat SCTransform v2 usuli yordamida normallashtirildi, 84 tasi barcha 7418 ta aniqlangan xususiyatlarni o'z ichiga oldi va ishtirokchilar orasidagi farqlar regressiya qilindi. Barcha tegishli metama'lumotlarni 28-qo'shimcha ma'lumotlar to'plamida topish mumkin.
Nashr vaqti: 2025-yil 10-sentabr